USP22去泛素化修饰Osterix调控间充质干细胞成骨分化

USP22 plays an important role in cancer initiation and progression and is proposed to be a "cancer stem cell" marker in a number of cancers. Interestingly, our recent study discovered that USP22 was highly induced during early osteogenic differentiation in human mesenchymal stem cells (hMSCs). Furthermore, know-down of USP22 in hMSCs resulted in a significant blockage of osteogenic differentiation. In the following proteomic screen, we identified the osteopath-specific transcription factor Osterix as one of the most down-regulated proteins upon USP22 knock-down. Notably, Osterix mRNA was not affected by the USP22 knock-down. Based on these interesting findings, we hypothesize that USP22 regulates osteogenic differentiation of hMSCs by deubiquitinating Osterix protein. To validate this hypothesis, we will focus on MSC osteogenic differentiation at cellular and molecular levels to address three questions. (1) Dose USP22 interact directly with Osterix? (2) Dose USP22 deubiquitinate Osterix directly during osteogenic differentiation? (3) Dose USP22 regulate of hMSCs osteogenic differentiation via modifying Osterix? This research will explore the novel physiological function of USP22 in osteogenesis, which will provide sufficient experimental evidence to support USP22 being a potential novel target for osteoporosis therapy.

泛素水解酶USP22被认为是肿瘤干细胞的标记基因。而我们发现USP22在骨髓间充质干细胞(MSC)的成骨分化早期出现显著上调，抑制其表达可致成骨分化受阻；差异蛋白质组学显示成骨特异性转录因子Osterix的蛋白表达受控于USP22变化，而mRNA水平不受影响。据此推测：USP22去泛素化修饰Osterix调控MSC的成骨分化。本项目以诱导MSC成骨分化模型为研究对象，采用基因克隆、定点突变、siRNA、免疫共沉淀等方法，在细胞与分子水平证实：(1) USP22与Osterix在细胞内存在直接的相互作用；(2) USP22直接调控Osterix泛素化水平，影响Osterix半衰期；(3) USP22通过Osterix调节成骨分化过程。研究结果将拓展USP22作用的新机制，获得USP22调控Osterix的直接证据，为确立USP22作为骨质疏松症治疗的新靶点提供充分的科学依据。

阐明间充质干细胞(hMSCs)定向分化为成骨细胞的分子机制对于防治骨质疏松症具有至关重要的意义。根据研究计划，我们证实USP22对Osterix的表达存在调控作用，但是这种作用并非通过直接的蛋白-蛋白相互作用的方式完成，我们猜想更为可能的是以一种间接方式。后续研究从以下几个方面展开：1）采用ATAC-seq技术（基于转座酶和高通量测序的染色质分析）在全基因组水平观察MSCs成骨分化早期染色质开放区域的动态变化，并对各组间染色质开放区域数量、开放区域的DNA基序以及邻近基因功能进行生物信息学分析。2）采用转录组测序分析了MSCs脂肪成骨细胞生成过程中3、5和7天激酶的基因表达情况。鉴定了编码激酶的重要差异表达基因作为两个分化事件的候选基因，进一步证实了PTK2B和PRKG2在成骨/成脂细胞形成过程中的基因功能。3）在MSCs的早期（第3-7天）脂肪细胞分化过程中，发现LRRC1在mRNA和蛋白质水平上均上调。此外，发现LRRC1的表达受PPARγ的控制。抑制LRRC1表达降低了hMSCs的成脂潜能，同时降低了三种脂肪生成相关蛋白（SCD、LIPE、FASN）的表达。4）以蛋白质翻译后修饰为切入点，发现赖氨酸乳酸化修饰在MSC成骨/成脂分化中的动态变化，利用修饰蛋白组学在未分化的MSCs组、成脂3天组和成骨3天组分别检测到375、318和294个可定量的乳酰化蛋白质，以1.5倍为差异阈值进行比较，在成骨分化第3天检测到16个升高的和100个下调的乳酰化蛋白质；在成脂分化第3天，升高及下调的乳酰化蛋白质数分别为19和91，表明MSCs进入分化后导致大部分蛋白质乳酰化水平的下降，随后对部分乳酰化蛋白质进行功能验证。我们的研究结果部分地阐明MSCs向成骨/成脂细胞分化的机制，对于深入理解hMSCs定向分化的调控网络并确立治疗骨质疏松新的新靶点具有积极意义。