结核分枝杆菌Rv0927c蛋白抑制炎症应答的分子机制

Mycobacterium tuberculosis have evolved several mechanisms to escape host immune defense system, such as anti-inflammatory effect, and thus survive within the hostile environment, then it leads to latent infection or disease. Previous study showed that Mycobacterium tuberculosis Rv0927c protein can downregulate induction of some proinflammatory cytokines, however, the molecular mechanisms are not fully understood. In this study, recombinant Rv0927c protein will be prokaryotic expressed, Mycobacterium bovis BCG △Rv0927c strain and recombinant Mycobacterium smegmatis overexpressing Rv0927c will be constructed as research materials. The inhibitory effect of Rv0927c protein on the inflammation of host cells will be investigated by the Luminex liquichip and qRT-PCR technology in vitro and in vivo, respectively. And a series of overlapping peptides encompassing the entire Rv0927c sequence will be used to investigate the functional domain of Rv0927c protein. Subsequently, the dependent signaling pathways of anti-inflammatory effect and regulated function of some signal molecule will be analyzed. Finally, the interacting protein of Rv0927c protein will be screened and verified by Co-Immunoprecipitation and GST pull-down technology. To clarify the anti-inflammatory effect and molecular mechanism of Mycobacterium tuberculosis Rv0927c protein on the host cells, which will provide new ideas for the further elucidation of immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis.

结核分枝杆菌为重要的人兽共患病原菌，其产生抑炎效应在内的多种免疫逃逸策略，从而引起潜伏感染或疾病发生，前期研究显示结核分枝杆菌Rv0927c蛋白可以抑制宿主炎症应答，但是其分子机制还不清楚。本研究通过原核表达Rv0927c重组蛋白，并构建牛分枝杆菌BCG Rv0927c基因缺失株及表达Rv0927c的重组耻垢分枝杆菌作为研究材料。通过体外、体内试验，分别从蛋白水平和转录水平探讨Rv0927c蛋白对于宿主炎症应答的抑制效应及其规律，以此为切入点，应用Rv0927c序列全覆盖重叠多肽，探究其发挥抑炎效应的功能区域。随后，进一步分析Rv0927c蛋白发挥抑炎效应过程中所依赖的信号通路，以及重要信号分子的调控作用，并运用Co-IP技术筛选验证Rv0927c蛋白发挥抑炎效应的互作蛋白。通过对结核分枝杆菌Rv0927c蛋白的抑炎效应及其分子机制研究，将为进一步阐明结核分枝杆菌的免疫逃逸机制提供新认识。

结核分枝杆菌为重要的人兽共患病原菌，其产生抑炎效应在内的多种免疫逃逸策略，从而引起潜伏感染或疾病发生，前期研究显示结核分枝杆菌Rv0927c蛋白可以抑制宿主炎症应答，但是其分子机制还不清楚。. 本研究以结核分枝杆菌Rv0927c为研究对象，首先成功构建结核分枝杆菌Rv0927c真核表达重组质粒、原核重组Rv0927c蛋白、过表达Rv0927c重组耻垢分枝杆菌，以及耻垢分枝杆菌基因缺失株，为后续研究提供必要生物材料。Rv0927c在细菌和感染后宿主细胞内定位研究结果显示Rv0927c蛋白主要表达于分枝杆菌的胞质和膜组份中；通过将过表达重组耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞、以及将真核质粒转染至HEK293细胞后进行激光共聚焦胞内定位分析，结果显示Rv0927c定位于细胞浆内和核内。.通过对结核分枝杆菌Rv0927c蛋白抑制宿主炎性效应进行了研究，结果显示真核表达质粒转染显著抑制PGN、LPS诱导的NF-κB信号通路活化、以及炎性因子分泌表达；重组Rv0927c蛋白刺激巨噬细胞可以抑制LPS诱导的细胞炎性因子表达；过表达Rv0927c重组耻垢分枝杆菌在体外实验、体内实验中均显著抑制小鼠巨噬细胞炎性因子的表达，同时Rv0927c蛋白提高细菌胞内存活和体内载量。进一步对结核分枝杆菌Rv0927c蛋白抑制宿主炎性效应分子机制进行探究，结果显示结核分枝杆菌Rv0927c通过降低p65、IκBα、p38、ERK1/2的磷酸化水平来抑制NF-κB、MAPK信号通路的活化。通过酵母双杂交技术筛选Rv0927c蛋白互作靶蛋白的筛选及验证，确定了结核分枝杆菌Rv0927c蛋白27个候选靶蛋白，为后续深入研究提供了线索。. 通过对结核分枝杆菌Rv0927c蛋白的抑炎效应及其分子机制研究，将为进一步阐明结核分枝杆菌的免疫逃逸机制提供新认识。