多肽HBSP保护猪移植肾的信号通路的动态网络研究

Helix B surface peptide (HBSP) is a novel renoprotective peptide,synthesized by our group and its patent received. Our preliminary studies have confirmed significant anti-apoptotic and anti-inflammatory effects of HBSP in renal ischemia reperfusion injury, but its intracellular signaling pathway still needs further research. We have established the kidney cold preservation and autotransplantation model in porcine. Porcine, as a research platform, displays unique advantages of diverse genetic background and its structural similarity to human kidney. Therefore, this project intends to evaluate the renoprotective effect of HBSP in the porcine autotransplantation model and to explore its mechanism. We will analyze HBSP-induced kidney protein expression changes on different timepoints with iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) labeling and quantitative proteomic technology, and screen out potential intracellular signaling pathways of HBSP by identifying differentially expressed proteins. We will further use siRNA to interfere with the expression of key molecules in the newly discovered signaling pathways in vivo for verification. This project aims to clearify the renoprotective mechanism of HBSP, providing theoretical support for its clinical translation in kidney transplantation.

HBSP(helix B surface peptide)是我们自主合成并已申请专利的肾脏保护性多肽，前期研究已证实其在肾脏缺血再灌注损伤中具有显著的抗凋亡和抗炎症的保护作用，但其对胞内信号通路的影响机制不明。目前我们已建立猪肾冷保存及自体移植模型，猪多样化的基因背景及与人接近的肾脏结构均使其作为研究HBSP肾脏保护机制模型具有独特优势。因此，本课题拟在猪自体肾移植模型中验证HBSP对移植肾的保护效应，并进一步应用蛋白组学技术探索HBSP在移植前后不同时间节点所引起的肾脏内蛋白表达谱变化，通过对差异蛋白的分析比对筛选出HBSP所作用的胞内信号通路，绘制HBSP动态胞内信号转导机制网络图。在此基础上，我们将在体内运用基因沉默技术siRNA对信号通路上关键接头蛋白的表达进行干预，验证信号通路，最终深入阐明HBSP对肾脏的保护作用机制，为HBSP的临床转化提供理论依据。

缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)作为肾移植中不可避免的病理生理过程，可促进细胞的凋亡和炎症反应，加重移植肾的损伤。我们根据促红细胞生成素（EPO）3D结构的β螺旋表面中11个氨基酸的序列自主合成了小分子多肽 HBSP (helix B surface peptide) ，我们首先评估了HBSP在体内的肾脏保护作用并阐明了机制。发现HBSP能通过PI3K/Akt通路大幅降低肾脏缺血再灌注损伤所引起的肾小管上皮细胞凋亡和间质炎症。但HBSP半衰期短，极大地限制了其临床应用前景。为此，我们发明了硫醚环肽 CHBP (cyclic helix B peptide)。大幅提升了稳定性和生物学活性。在肾脏缺血再灌注损伤后的早期及恢复期，我们发现CHBP 能减轻急性损伤，并抑制远期纤维化。我们检测由 CHBP引起的不同时点细胞内蛋白表达谱的变化，筛选差异蛋白并进行了验证，揭示 了CHBP的重要信号通路，并最终绘制了动态网络图。为了充分模拟临床，我们采用猪的自体肾移植缺血再灌注损伤模型，研究基因治疗对供肾和移植肾的保护作用。我们发现裸露的Caspase-3 siRNA通过肾动脉直接给药并冷保存24h后对供肾具有显著的保护作用，但是对移植2天后的移植肾却没有保护作用，并且增加了炎症反应和细胞凋亡。我们研究发现，短效的Caspase-3 siRNA治疗引起了固有免疫中TLR3、TLR7和PKR的激活，导致机体系统性的反馈调节。为此，我们使用LNA技术修饰的血清稳定型的Caspase-3 siRNA，延长观察期至移植后2周，发现血清稳定型Caspase-3 siRNA显著保护了供肾及移植肾，具有巨大的临床转化价值。这些结果为今后防治缺血再灌注损伤的器官保护药物的设计和临床前研究提供了宝贵的实验数据。