基于无视力障碍的血管性痴呆大鼠的p-CREB双靶向调节机制及石杉碱甲的相关保护机理研究

血管性痴呆(VaD)的发病机制复杂，迄今未有确切定论。本研究拟在前期工作的基础上，建立无视力障碍的lister hooded或Long-Evans大鼠VaD模型，排除视力因素对空间学习记忆的影响，模拟临床上VaD病患的慢性神经退行性变。本项目拟通过整体和离体实验，揭示VaD发病过程中反应性星型胶质细胞(Ast)的炎症损伤和BDNF保护机制，并进一步阐明p-CREB在两种机制中的调节作用。同时，基于早期研究发现痴呆治疗有效药物Huperzine A同时具有抗炎和神经营养作用的数据，本项目将深入分析Huperzine A的保护作用与p-CREB通路的关系，以期间接验证该双向调节靶点在VaD有效防治中的作用并进一步阐明Huperzine A的药理机制，为研发新一代VaD治疗策略以及扩大Huperzine A的临床应用提供重要依据。

课题第一部分，采用大鼠双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid arteries occlusion, 2-VO）模型，研究慢性脑血流低水平灌注所诱导认知功能障碍究竟归因于视力损伤还是认知功能损害。大鼠的空间学习记忆功能在双侧颈总动脉结扎46天后产生障碍，采用Morris水迷宫隐藏平台和可见平台测试（视力依赖的认知行为学）均发现2-VO大鼠找到平台的潜伏期与sham组相比显著延长，且组织学显示视网膜严重损伤；进一步采用声音条件恐惧测试（非视力依赖认知行为学）发现2-VO大鼠静止不动的比率显著下降。2-VO并不能引起灰质明显损伤，表现为海马和前额叶皮层无明显结构变化及突触素、突触后密度蛋白95和胶质细胞（星形胶质和小胶质细胞）数目不变。2-VO术后第3天在胼胝体而非内囊观察到明显的炎症反应，随时间延长在术后第14天和60天降低到正常水平。对大鼠视束部位检查结果显示，2-VO术后第3天、14天，增生的星形胶质细胞和活化的小胶质细胞明显增加，且持续到60天。2-VO后60天可以观察到视束而非胼胝体体和内囊，神经纤维排列混乱。提示，2-VO严重损害大鼠视网膜从而导致视力相关的认知障碍；2-VO诱导明显的白质内时间、部位特异性炎症反应也促进视力和非视力相关的认知功能障碍。第二部分，进一步研究视网膜损伤机制，发现小胶质细胞活化及炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA水平在缺血早期（术后3天）最高，Müller细胞持续性增殖至术后60天；神经营养因子NGF、BDNF和NT-3的mRNA或蛋白及其受体TrkA、TrkB和TrkC的含量均显著持续降低；在缺血过程中，iNOS的基因和蛋白水平也发生持续下降；线粒体呼吸链酶复合物IV（complex IV）减少，持续至术后60天；信号分子ERK1/2和CREB的磷酸化水平均下降。研究提示，2-VO后ERK1/2和CREB的磷酸化水平降低使炎症因子和神经营养因子基因转录失衡，导致对抗炎症反应因子减少、持续性的神经营养因子缺乏、iNOS的减少和线粒体损伤是视网膜损伤的重要机制。第三部分，研究石杉碱甲 (Huperzine A) 对慢性脑血流低水平灌注所导致的空间认知障碍、视网膜损伤的改善作用及相关机制。研究表明Huperzine A不能降低水迷宫测试中2-VO引起的大鼠逃避潜伏期延长，但能够减轻视网膜损伤，减少2