基于微纳磁球的高灵敏阻抗免疫分析方法及在食物过敏原检测中应用的研究

In this project we propose a novel impedimetric immunoassay method for the detection of trace proteins in food samples. In this approach, firstly the target proteins in the sample are captured on the magnetic beads with antigen/antibody reaction. Then, under the effect of external magnet, the magnetic beads are enriched on the electrode surface through the second antibody which is immobilised on the electrode. Finally, impedimetric measurement is employed to determine the concentration of magnetic beads, which is related to the concentration of target protein in the sample. In this project, we will investigate 1) the electrical frequency properties of micro/nano magnetic beads; 2) modelling the movements of magnetic beads under the effect of external magnetic field; 3) the optimization of impedance measuring structure; 4) the screening of multi-allergens in the sample through impedimetric array. This method is capable of handling complex food samples. And it has the advantages such as short response time, high sensitivity, and simple measurement setup, which facilitates its applications on rapid screening of food samples. In this project, food allergen (ovalbumin etc.) is selected as detection target. At the same time, this method can also be easily extended to the detection of other macromolecular proteins in food samples. To our knowledge, there is no report of such method in the literatures up to now.

本项目提出了一种食品中微量蛋白质的高灵敏阻抗免疫检测新方法。该方法首先利用带有一抗的免疫磁球在样本中对被测物进行捕捉，然后进行磁分离，之后在外加磁场作用下，在带有检测抗体的电极表面快速富集磁球并进行免疫反应，最后利用磁球的几何尺寸，采用简便、稳定的阻抗法进行高灵敏检测。项目研究的具体内容包括：1）微纳磁球的电频谱特性；2）不同磁球在外加磁场作用下运动及对免疫反应影响的建模研究；3）阻抗测量结构的优化；4）过敏原多目标筛查阵列等。该方法能够对复杂食品样本进行有效预处理富集，具有磁球免疫反应速度快、阻抗检测灵敏度高、装置简单、检测结果稳定、易定量等优点，能够满足食品快速检测筛查的需要。在项目的实施过程中，选用越来越引起人们关注的食物过敏原（卵白蛋白等）作为检测目标。同时，该方法也可以方便地拓展到食品样本中其他大分子蛋白的检测中去。根据我们的了解，目前国内外还未有相似方法的研究报道。

本项目主要研究电化学免疫分析技术和相应的功能材料制备方法，以简化现有的免疫分析方法，并探索高灵敏度的现场免疫分析方法。在项目的资助下，已取得以下主要成果：1）研究和优化了微磁球的制备技术，并通过对其表面的功能化，将其应用于免疫检测中；针对磁球粒径控制问题，探索了高分子微球制备及其对氧化铁磁颗粒的包裹制备技术。2）研究了基于免疫磁球的酶联免疫检测技术，提出了单个磁球的有效免疫反应体积的概念。基于这一技术，优化了基于磁球的免疫反应检测体系，提高了检测灵敏度，降低了试剂消耗。3）研究电化学检测技术在酶联免疫分析中的应用。和光学检测方法相比，电化学检测具有成本低、使用方便等一系列优点，但是目前电化学免疫检测还存在一些有待解决的问题。项目针对碱性磷酸酶标体系中产物对硝基苯酚容易在电极表面引起钝化这一问题，研发了基于功能材料的抗钝化电极，优化了电极制备方法，实现了电化学酶联免疫检测，为电化学免疫分析技术应用于现场检测提供了基础。4）在上述研究的基础上，进一步开展基于分子生物学技术的过敏原检测方法的研究。研究发现了基于三联尿嘧啶序列的Cas12a酶的新PAM，从而在基于CRISPR检测的PCR扩增体系中，可以使用尿嘧啶来代替胸腺嘧啶，提高检测系统的防污染能力，有助于现场检测技术的研发。在上述成果的基础上，项目共发表标注有项目资助的论文11篇，其中SCI影响因子大于5的论文有7篇，所发论文已被应用54次；申请国家发明专利3件。项目已培养博士研究生3名，硕士研究生2名。