利用介体昆虫细胞培养和RNAi体系研究水稻矮缩病毒的复制机理

The rice dwarf disease caused by Rice dwarf virus (RDV) is one of the important rice virus diseases in eastern Asia. The nonstructural viral proteins Pns6, Pns11 and Pns12 were the constituents of the matrix of viroplasms, the sites for viral replication and assembly of progeny virions. The minitubular structures, constructed by the nonstructural viral protein Pns4, localized at the periphery of the matrix of viroplasm. All these four nonstructural proteins were thus considered as the possible key factors of viral replication. In this proposal, we want to knock down the expression of each viral gene from these four nonstructural proteins by using RNA interference, to test whether viral replication and multiplication also were suppressed in virus-infected cultured insect vector cells. This experiment would open an opportunity for us to identify key factors of viral replication and to understand the molecular mechanism of viral replication. Furthermore, we want to knock down the expression of viral genes from key factors of viral replication by ingestion of in vitro synthesized dsRNAs from the targeting genes into leafhopper vectors, to test whether the formation the matrix of viroplasm also was suppressed in the epithelial cells of alimentary canal, which would lead to the blockage of viral capability to exploit the viroplasm for viral replication and assembly of progeny virions in the body of insect vector. All these data would provide theory basis for designing efficient control disease strategies in future.

由水稻矮缩病毒 (RDV) 引起的水稻矮缩病是东亚地区常年流行的重要水稻病毒性病害。RDV编码的非结构蛋白Pns6、Pns11和Pns12被认为是形成提供病毒复制和装配的病毒原质(viroplasm)基质的病毒组分，非结构蛋白Pns4形成的微管则聚集在基质周边，这些蛋白都有可能是病毒复制关键因子。本项目拟通过RDV侵染的介体叶蝉培养细胞体系验证通过RNA干扰技术抑制Pns4、Pns6、Pns11或Pns12基因的表达后，病毒在介体培养细胞中的复制和增殖也同时被抑制的程度，鉴定病毒复制关键因子，解析RDV的复制机理。探索通过取食病毒复制关键因子基因的dsRNA抑制靶基因在叶蝉体内的表达，同时抑制RDV在叶蝉消化道上皮细胞中有效启动装配viroplasm基质的能力，从而阻断病毒利用viroplasm在介体体内有效复制或装配子代病毒粒体的能力，为进一步制定有效控制此类病毒的新策略奠定基础

由水稻矮缩病毒 (RDV) 引起的水稻矮缩病是东亚地区常年流行的重要水稻病毒性病害。RDV 编码的非结构蛋白 Pns6、Pns11 和 Pns12 被认为是形成提供病毒复制和装配 的病毒原质(viroplasm)基质的病毒组分，非结构蛋白 Pns4 形成的微管则聚集在基质周边， 这些蛋白都有可能是病毒复制关键因子。本研究通过RNA 干扰技术抑制 Pns6、Pns11 或 Pns12 基因在介体黑尾叶蝉单层培养细胞和介体叶蝉虫体内的表达，干扰后，病毒在介体细胞和虫体内的侵染率和扩散能力相比对照dsGFP处理组都明显的下降，无法表达基因相应的蛋白，而且只要沉默其中一个片段，都会导致另外2个蛋白无法正常表达，并且在细胞内无法形成完整的病毒原质viroplasm，明确了Pns6、Pns11和Pns12三个蛋白与病毒在介体细胞内的复制和子代病毒粒体装配的场所——病毒原质的形成相关，皆为RDV的复制关键因子，缺失任何一个因子，都将导致病毒复制受影响，同时对另一个非结构蛋白Pns4的功能验证结果表明Pns4可能参与了病毒的复制和装配过程。研究成果建立了适合黑尾叶蝉体内及其培养细胞RNAi技术体系，克服了由于缺乏反向遗传学技术，而无法在病毒侵染的情况下研究RDV功能的瓶颈，为建立基于阻断病毒在介体内有效复制的调控策略提供理论基础，具有一定的创新性和科学意义。