白僵菌素在香蕉枯萎病菌热带4号小种致病过程中作用机理研究

Fusarium wilt, caused by the fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical Rce 4 (Foc TR4), is the most destructive diseases of banana. The pathogen produces BEA, which had been proved by our privious research. As virulent factors, BEA may play an important role during the pathogenic process. In order to prove this hypothesis, in this study (1)we will construct the BEA synthesis mutant and observe the changes its virulence, and determine the importance of this toxin in the pathogenicity of the pathogen;(2)we will treat the tissue cultue plantlets of a susceptible banana cultivar---Baxi(AAA) with BEA, subsequently the transcriptomics, proteomics and pathological changes will be anlysized, and also their toxic mechanism will be determined in the molecular level;(3)we will investigate the possible interaction promotor and protein with BEA by the improved method of gel retardation and Co-IP respectively;(4)the significant differential expression genes will be validated by Virus-Induced Gene-Silencing (VIGS);(5)The above results will also be confirmed by some physiology and biochemistry tests.The results are expected to help us understand the specific roles of toxins during the pathogenic process, which not only filled a part of blank of the pathogenic mechanism, but also provide the clues for designing molecular therapy and prevention methods of the toxin synthesis and secretion related genes in the future.

香蕉枯萎病菌热带4号小种（Foc TR4）严重威胁我国香蕉产业的发展。该菌生物合成白僵菌素（BEA），本课题组已证明该毒素能引起香蕉假茎腐烂、幼苗和细胞死亡，为深入探讨其致毒机理，本项目拟（1）构建BEA生物合成突变体，通过研究BEA生物合成量与其致病力强弱之间的关系，证实BEA在Foc TR4致病过程中的重要性；（2）根据BEA在细胞内的分布规律，利用改良凝胶阻滞和免疫共沉淀技术，寻找其互作启动子和蛋白，以明确其作用位点和方式；（3）利用BEA处理香蕉感病品种根系，通过比较处理前后转录组和蛋白质组学水平上的变化，从整体水平揭示BEA致毒调控网络；（4）利用病毒介导的基因沉默技术及生理生化手段进一步验证（2）和（3）中的BEA致毒相关基因和蛋白，以明确BEA致毒机制。研究结果不仅将弥补Foc TR4 致病机理上的部分空白，也为我们今后设计针对毒素合成和分泌相关基因的分子防治手段提供线索。

香蕉枯萎病菌热带4号小种（Foc TR4）严重威胁我国香蕉产业的发展，该菌生物合成白僵菌素（BEA），本课题组已证明该毒素能引起香蕉假茎腐烂、幼苗和细胞死亡。在本项目的资助下，对BEA的毒性机理开展进一步研究。离体培养24个VCGs Foc菌株，分别接种巴西蕉或者粉蕉组培苗, 发现毒素生物合成量越大的菌株，致病性越强。对田间发病香蕉植株毒素含量进行研究，发现假茎、叶片和根系中均能检测到BEA，说明BEA是Foc一种组成性的毒性成分;对BEA细胞毒性开展研究，发现BEA可引起ROS爆发、ΨΔm下降、DNA损伤等，导致细胞死亡; 构建了Foc TR4 BEA生物合成途径限速酶Bbeas的基因敲除突变体，与野生型菌株相比较，突变体BEA的生物合成量显著降低，致病性完全丧失，表明BEA是Foc TR4致病性不可或缺的因素; 根据Bbeas蛋白功能域设计小干扰RNA，筛选到三个siRNA能够显著抑制Foc TR4的生长,目前根据这些靶点构建了寄主诱导基因沉默载体, 正在转化巴西蕉悬浮细胞。利用RNAseq和TMT技术研究了BEA在毒性浓度下激发的‘夫人指蕉’ ECS 的响应机制，结果表明：BEA可抑制细胞生长、细胞周期、DNA合成、ECS转录调控;可诱导过氧化物酶、抗坏血酸盐、谷胱甘肽和泛素依赖的蛋白降解等相关基因的上调表达。. 对来自不同香蕉生产国的55 个Foc菌株（涵盖4个生理小种、24个VCGs）， 包括6株Foc TR4，8株Foc STR4 (亚热带4号小种)，35株Foc race 1，2株Foc race 2，2株大蕉 Foc，2株非致病性尖孢镰刀菌，进行了基因组重测序，测序覆盖度均在50倍以上。研究了全球范围内的Foc的进化规律,发现Foc TR4进化非常保守; 预测了各测序菌株的效应蛋白, 利用比较基因组学方法鉴定到各各生理小种和VCGs特异的效应蛋白，对部分基因敲除, 筛选到一些对致病性影响较大的效应蛋白。. 研究结果深化了对Foc TR4 致病机理上的认识，找到了一些针对毒素合成相关基因的分子防治手段。