通过外显子测序探寻转移性胰腺癌的突变富集通路

胰腺癌是消化系统恶性程度最高的肿瘤。目前对于胰腺癌转移性克隆的形成，以及肿瘤如何扩散等基础问题尚不明确。其中一个重要的问题是：肿瘤细胞是获得足够恶性表型前离开原发灶，在远处进行体突变进展和转移生长，还是在原发灶中发展成具有转移生长能力的恶性肿瘤。因此对转移性胰腺癌的临床、基因和分子特征的充分研究可以为胰腺癌的治疗干预开辟新的领域。本课题组在前期工作的基础上，拟开展以下几方面的研究：（1）通过外显子组测序及生物信息学方法对转移性胰腺癌患者进行DNA水平突变变异筛查；（2）对相关突变基因的表达水平进行分析，探究其是否与胰腺癌发生及转移相关；（3）检测胰腺癌患者和正常人外周血中游离突变基因的表达水平，探讨其做为胰腺癌早期筛查诊断的特异性肿瘤标志物的可行性；（4）以胰腺癌细胞株为模型，分别过表达或低表达各突变基因进行体外实验研究；（5）通过动物模型，检测突变基因对肿瘤生长及转移的作用。

我们(1)利用外显子捕获及高深度测序分析一名转移性胰腺癌患者的配对原发胰腺癌和正常胰腺组织、配对肝转移肿瘤和正常肝组织及血液；利用生物信息分析评估突变读取的敏感性和特异性，重新排列测序分析和错误排列区域，读取单核苷酸变异，比较外显子组测序数据与SNP芯片基因型的符合度，检测拷贝数变异（CNV），确定转移肿瘤中高等位基因频率的功能性突变，IPA分析候选基因的通路。利用芯片比较基因组杂交（aCGH）技术分析DNA拷贝数，利用Sanger测序、Sequenom质谱、Fluidigm Digital PCR验证体细胞突变。在转移性肿瘤中共有65个SNVs的等位基因频率（AF）显著升高，12个基因不仅具有较高的等位基因频率并有功能性突变，包括已知基因KRAS和TP53基因。10个新的候选基因，其中6个（ADRB1、DCLK1、KCNH2、NOP14、SIGLEC1和ZC3H7A），与KRAS和TP53共同聚集在同一个与癌症发展有关的网络通路中（p值=1×10-22）。(2)利用免疫组化方法观察候选基因在胰腺癌组织中的表达；通过转染siRNA方法观察候选基因对胰腺癌细胞的迁移、增殖和克隆形成能力的功能影响。候选基因DCLK1、KCNH2和SIGLEC1在胰腺癌组织中异常表达，敲低候选基因ADRB1、DCLK1、KCNH2、NOP14和SIGLEC1的表达降低了胰腺癌细胞的迁移、增殖和集落形成能力。(3).通过在胰腺癌细胞中敲低或高表达候选基因NOP14，观察胰腺癌细胞增殖、迁移和体内转移的能力。观察与迁移相关的蛋白质的表达水平，如E-cadherin、Vimentin、MMP9和RhoA，以及增殖相关的蛋白质的表达水平，如p53、MAPK3和CDK2。在高迁移能力的胰腺癌细胞中抑制NOP14的表达，降低了细胞的迁移、增殖和体内的转移能力。相反，在低迁移能力的胰腺癌细胞中升高NOP14表达，增加了细胞的迁移、增殖和体内的转移能力。伴随NOP14表达水平的变化，迁移相关的蛋白质如E-cadhrein、Vimentin、MMP9、RhoA和突变型p53，连同增殖相关的蛋白质如磷酸化的MAPK3和CDK2的表达水平也随之发生相应的改变。