干细胞冷冻保存过程的损伤机理研究

冷冻是建立细胞库、保持生物活性物质长期稳定的有效方法。本项目提出细胞活率和细胞功能完整性是判断冷冻保存成功与否的关键。首先在宏观上分析测定细胞膜在不同温度下的渗透参数，建立冷冻过程传质模型，确定细胞体积变化和细胞死亡的关系。然后根据冷冻保存过程中在离解、冷冻保护剂导入、冷冻和冷冻保护剂移出各步骤中产生的离解压力、渗透胁迫和氧化应力等对人诱导性多能干细胞（iPSCs）的活率、程序化死亡率、细胞内的过氧化氢、超氧离子含量、f-actin,caspase-8/9、p53、cyt-c、Rho、ROCK、Fas、FasL、integrin、E-cadherin等的影响，确定其程序化死亡路径，从微观分子水平上揭示iPSCs冷冻保存过程的损伤机理，以此设计新型冷冻保护液和复苏液，为iPSCs未来商业化过程中规模化长期稳定存储困难的解决奠定理论基础。

干细胞包括多能干细胞和全能干细胞，其具备自我更新能力，并可在一定的条件下分化成具备特定生物功能的细胞。正是由于干细胞的自我更新和分化能力，干细胞在疾病模型建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价等领域有巨大应用价值。为满足未来强大需求，必须实现干细胞的规模化长期稳定保存。超低温慢速冷冻是干细胞成功商业化的必要手段。尽管超低温慢速冷冻能保护细胞，但过程应力可能会对细胞造成不可逆转的损害，这成为其商业化应用的瓶颈。在本项目中我们探讨了超低温慢速冷冻过程中各个步骤可能产生的解离应力、渗透胁迫和氧化应力等对干细胞造成的损害，揭示了干细胞冷冻损伤机理，并在此基础上设计新型冷冻保护液和复苏液，以降低冷冻损害，提高冷冻复苏率，以此解决干细胞商业化过程中的困难，为阐释干细胞冷冻损伤问题奠定理论基础。. 首先，根据细胞在不同渗透应力下的体积变化，确定了人多能干细胞在不同冷冻保护剂条件下细胞膜对水渗透系数和对冷冻保护剂的渗透系数、膜渗透系数。结果表明，人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞具有生物物理学差异。确定了细胞膜渗透参数和温度的关系，活化能大于6 kcalmol-1说明冷冻保护剂的运输很可能不是通过膜蛋白介导机制完成的，并预测了最佳冷冻速率。进一步考察了干细胞在不同贴壁条件和悬浮状态下对冷冻过程的敏感性。研究表明在二甲基亚砜条件下，1 ◦C/min 的降温速率有助于维持细胞形态、肌动蛋白的完整性及更高的冷冻复苏率。另外通过改变基质的构成能提升细胞冷冻后的活率和冷冻复苏率。.其次，考察了解离应力对人多能干细胞在解离过程和冷冻复苏的影响。我们发现解离后的细胞培养中引入蛋白激酶A（PKA）抑制剂H89，有效地抑制了解离诱导的蛋白激酶A和ROCK激活，抑制了细胞死亡和细胞起泡，从而显著提高了解离细胞的活率和克隆形成。PKA抑制剂的引入未影响人多能干细胞的干性和分化性能。在此基础上我们设计了新型冷冻保护液和冷冻复苏液。新型复苏液的使用将解离的人多能干细胞的冷冻复苏率显著提升，克隆形成数目与使用传统复苏液相比提高了3倍左右。对于无饲养层培养的人多能干细胞而言，冷冻液中H89的存在也极大地抑制了细胞凋亡，提升冷冻后细胞复苏率。新型冷冻保护液和冷冻复苏液的使用未影响人多能干细胞的干性和分化性能。这一新的冷冻保存方法将极大地加速人多能干细胞的处理过程，满足其在研究和临床的广泛应用。