利用CRISPR/Cas9技术研究hsa-miR-374a在HBx和TGF-β诱导肝卵圆细胞恶性转化中的作用

HCC with tumor thrombus is a vital factor which influenced the survival time after heptatectomy. But until now, nearly no research has revealed the mechanism of HCC with tumor thrombus. Oval cell is the progenitor cell of liver. Many studies has reported that it was related with the origin of HCC. Our group has fund that HBx and TGF-β could induce the differentiation of the oval cell, formation of HCC, and promote the invasion and migration ability. And miR-374a has been detected as a key molecule in the downstream of HBx and TGF-β. In this research project, we intend to confirm the miR-374a`s function in the process during HBx and TGF-β inducing the differentiation of the oval cell and provide a new target for treating HCC patients with tumor thrombus.

肝癌合并癌栓是影响手术后生存时间的一个重要因素，但是目前肝癌合并癌栓的发病机制目前并不清楚。卵圆细胞是肝脏组细胞，已有较多研究发现卵圆细胞的分化与肝癌发生相关。本课题组前期研究发现HBx与TGF-β共同通过MAPK信号通路刺激卵圆细胞向肿瘤干细胞分化并增强其侵袭转移能力，同时hsa-miR-374a作为HBx，TGF-β下游MAPK信号通路的关键分子在卵圆细胞分化、癌变的过程中起着重要作用。该课题将深入研究hsa-miR-374a在HBx和TGF-β诱导肝卵圆细胞恶性转化中的作用，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，进一步研究其作为治疗肝癌合并癌栓的新靶点的意义。

肝癌的发病机制是目前国际上研究的热点，但肝癌合并癌栓的研究较少。这部分肝癌病人预后较差，5年生存率低。本课题提出假设：由于HBx以及TGF-β的影响，miR-374a的表达水平上调，导致肝脏卵圆细胞活化并分化形成肝癌细胞，并导致血管侵犯形成癌栓。课题整体完成情况良好，在人体肝癌标本中，卵圆细胞特异性标记CK19的表达水平明显高于癌旁组织，同时在血管侵犯肝癌组织中HBx以及TGF-β的表达水平明显高于不合并血管侵犯的标本。进一步检测发现miR-374a的表达水平与HBx以及TGF-β的表达水平呈现正相关。在细胞实验以及动物实验中进一步研究表明：HBx以及TGF-β共同刺激可以诱导卵圆细胞LE/6向恶性转化，并导致其增殖以及侵袭转移能力明显升高。通过进一步的实验研究证实，miR-374a在HBx以及TGF-β共同刺激下卵圆细胞中的表达水平明显升高，其表达水平升高与下游共同信号通路MAPK的活化导致c-jun的磷酸化有明显相关性。通过CRISPR-Cas9技术敲除miR-374a在卵圆细胞中的表达后，miR-374a的表达水平明显下调。同时敲除后HBx以及TGF-β诱导刺激卵圆细胞增殖以及侵袭能力增强的情况得以逆转。综上所述，课题组可以得出结论HBx以及TGF-β共同刺激可以诱导卵圆细胞分化并形成肝癌，同时miR-374a作为其中的关键分子参与其诱导过程。