基于新材料和新试剂的糖基化蛋白质、糖链规模化分析新方法研究

Supported by the NSFC project, we developed a series of new glycoprotein or glycan enrichment and identification methods using functionalized gold nanoparticles, grapheme, three dimensional wave-like polymer modified open tubular columns, hairy polymer hybrid nanoparticles and various of derivatization reagents. Highly efficient glycoproteins digestion, glycopeptides and glycan enrichment as well as enrichment process monitoring was achieved. Furthermore, the detection sensitivity of glycans in mass spectrometer (MS) was increased by one to two orders of magnitudes after derivatization. Next, we thoroughly studied the N-glycosylation of glycoprotein CD44 which is closely correlated with tumor metastasis. We also developed a new core fucose glycosylation quantification method using multiple reaction monitoring technique. We published three manuscripts in “Analytical Chemistry”. To further improve the enrichment efficiency and detection sensitivity of glycoproteins, glycopeptides and glycans, we plan to develop new enrichment materials and establish combined enrichment-derivatization-desalting methods to largely reduced sample loss. New anionic ion derivatization reagents will also be designed to improve the ionization of sialic acids containing glycans in MS. Furthermore, we want to synthesis new polymer hybrid packing materials for on-line separation and MS analysis of derivatized glycans. We expect these new glycoproteins analysis strategies to support the function study of glycosylation and discovery of glycoprotein biomarkers.

申请人开展了基于新材料和新试剂的糖蛋白、糖链富集、鉴定新方法研究。制备了新型功能化纳米金、石墨烯、开管柱和纳米颗粒，并发展了多种糖链衍生化试剂。实现了糖蛋白的高效酶解，糖肽和糖链的有效富集，将糖链的质谱鉴定灵敏度提高了1-2个数量级。在此基础上对肿瘤转移相关糖蛋白 CD44的N-糖基化进行了全面研究，发展了基于质谱多反应监测技术的核心岩藻糖肽定量新方法。在Analytical Chemistry发表论文三篇。针对青年项目研究过程中发现的新问题并结和目前蛋白质糖基化分析技术的发展趋势，申请人拟发展更为高效的新型富集材料，建立富集-衍生化-脱盐集成化方法，在显著提高富集效率和质谱响应的前提下，大幅降低样品损失；设计新型负离子衍生化试剂，显著提高唾液酸糖链的质谱鉴定灵敏度；并制备新型聚合物杂化色谱填料，建立衍生化糖链的在线分离-质谱鉴定新策略。为糖蛋白的功能研究和生物标志物的发现提供技术支撑。

蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的翻译后修饰之一，参与介导了细胞-细胞、细胞-间质之间的多种相互作用，包括信息交流、识别与迁移、免疫应答等。糖蛋白的糖基化程度、糖链结构的非正常改变，不仅直接影响糖蛋白的生理功能，还与许多病理过程直接相关，特别是在肿瘤细胞的侵袭和转移中具有不可忽视的作用。由于蛋白质的糖基化修饰存在种类繁多、复杂程度高；糖链修饰具有微不均一性，且丰度偏低；糖肽和糖链的质谱分析灵敏度差等问题，发展糖肽、糖链富集新方法是实现糖基化鉴定重大突破的主要途径。针对上述蛋白质糖基化研究中迫切需要解决的技术瓶颈和难点，我们开展了一系列研究工作。..经过2013-2016四年实施，本项目进展顺利，完成了申请书和计划书中的既定研究内容。从蛋白质样本的高效酶解，低丰度功能蛋白质、修饰蛋白质及多肽的特异性富集和原位成像等多个方面入手，合成了多种高效酶解试剂、新型富集材料，建立了一系列高选择性的富集新方法，显著提高了鉴定灵敏度和规模。已发表基金署名SCI收录论文16篇，其中Analytical Chemistry 5篇，Chemical Science 2篇；申请发明专利5项，授权发明专利3项，超额完成了项目计划书规定的指标。依托本项目所发展的新技术新方法，被国家重大科学研究计划 “中国人类蛋白质组草图（CNHPP）”项目作为重要支撑技术所采用。为基于翻译后修饰蛋白质组的肝癌病人分子分型，药靶筛选和精准治疗研究提供了有力支持。