酶水解大豆蛋白中二硫键分布、结构状态以及非天然连接模式的全局性表征

巯基/二硫键含量、巯基/二硫键在肽链上的分布以及二硫键存在形式（链间二硫键/链内二硫键）等状态参数对酶水解蛋白的功能特性、生物活性、加工特性等有着重要影响。蛋白质酶水解产物中含巯基/二硫键肽段的结构分布范围相当宽，同时这一体系中不同结构的含巯基/二硫键肽段处于动态平衡过程中。因此本项目没有将重点放在个别含巯基/二硫键肽段的具体结构分析上，而是对系统中巯基/二硫键的状态进行全局性表征。项目拟采用二硫键蛋白质组学、结合质谱等方法，考察大豆蛋白酶水解产物中巯基/二硫键在不同分子量、电荷和疏水性区段中的分布情况，链间/链内二硫键的相对含量，以及非天然巯基/二硫键的存在情况，从而获得与分子量分布，电荷分布，或疏水性分布相当的全局性结构参数。通过本课题的研究将使我们更进一步认识酶水解大豆蛋白的结构- - 功能关系，进而为酶水解工艺的设计与控制以及酶水解产物分离工艺的设计与控制提供理论指导。

巯基/二硫键含量、巯基/二硫键在肽链上的分布以及二硫键存在形式（链间二硫键/链内二硫键）等状态参数对酶水解蛋白的功能特性、生物活性、加工特性等有着重要影响。蛋白质酶水解产物中含巯基/二硫键肽段的结构分布范围相当宽，同时这一体系中不同结构的含巯基/二硫键肽段处于动态平衡过程中。因此本项目没有将重点放在个别含巯基/二硫键肽段的具体结构分析上，而是对系统中巯基/二硫键的状态进行研究。项目首先建立了蛋白水解物中巯基含量的检测方法，在此基础上考察了不同水解度、不同酶解条件（温度、pH）下酶解物中游离巯基及二硫键的含量变化，并通过色谱分析考察了酶解物中半胱氨酸在不同分子量、电荷区段的分布情况。随着水解度的增大，酶解物中游离巯基有先增大后减小的趋势，而二硫键含量无显著性差异。水解温度和pH对水解物中游离巯基、二硫键、总巯基含量影响不大，但会影响巯基、二硫键的分布。DH 5%的酶解物中的半胱氨酸主要分布在分子量小于5000的肽段中，所占比例约为70%左右。IE-HPLC荧光检测结果表明，含巯基的肽段的有约50%在未被阴离子交换树脂吸附的地方洗脱下来，而此部分肽段应在pH8.0时带正电荷。胃蛋白酶选择性地酶解大豆11S球蛋白。酶解6h后，MW>10kDa的部分占21.34%，其中主要是7S球蛋白；MW<5 kDa的部分占68.30%。随着酶解，游离巯基含量呈现先增大后减小趋势，二硫键的含量变化不大。研究结果以期为大豆蛋白酶水解条件控制、水解产物的分离以及产品的应用研究提供理论依据。