细胞内特异信使RNA定点m6A甲基化调控

N6-methyladenosine (m6A) is the most prevalent internal modification in mammalian messenger RNA (mRNA), and has received considerable attentions from the community due to the increasing discoveries of its fundamental biological roles. About 25% of human mRNAs are modified with m6A which is enriched in 3’untranslated region and near stop codon. The mRNA m6A methylation has been closely associated with cellular metabolism and organismal development, however, there is a lack of such tool to manipulate specific m6A methylation in particular mRNAs, and it is thus hard to decode the connections between m6A methylation and cellular signaling pathways. In this project, we will integrate m6A methylation/demethylation enzymes and dCas13b RNase to develop a tool which is able to tune m6A methylation at specific sites in particular mRNAs. This tool will largely facilitate the studies towards including the functions of single-site m6A methylation, the effects of different methylation mark positioned along mRNA chain on its metabolism, and the roles of specific mRNA methylation in the key signaling pathways of certain disease model. We believe that the current research will significantly contribute to the fields of cellular RNA chemical modification and RNA editing.

N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰是哺乳动物细胞信使RNA(mRNA)内部所有碱基化学修饰中丰度最高的，因其重要的生物学功能受到科学家广泛关注。人体细胞内约25% mRNA含有m6A修饰，这些修饰主要集中在mRNA 3'端非编码区和近终止密码子。mRNA m6A修饰与许多细胞重要代谢和个体发育过程相关，但当前由于缺乏单独调控某种mRNA指定位点m6A甲基化的工具，很难直接关联m6A甲基化和细胞信号通路的因果关系。在本申请项目中，我们将通过融合mRNA m6A甲基转移酶/去甲基化酶和dCas13b RNA内切酶的方法,发展细胞内特定mRNA上精确位置m6A甲基化调控的工具。该工具将对研究mRNA单个位点甲基化功能、研究不同位点甲基化对RNA代谢的影响、以及探索疾病模型中重要信号通路基因mRNA甲基化的作用提供便利。该项目的研发将对细胞内RNA化学修饰调控和RNA编辑领域做出突出的贡献。

细胞内信使RNA（mRNA）N6-甲基腺苷（m6A）对基因表达调控有至关重要的作用，当前主要通过调控甲基转移酶或去甲基酶表达的方式对m6A功能进行研究，这会改变细胞整体m6A修饰的水平，难以精确研究特定位点m6A的功能。在此项目中，我们针对当前m6A修饰调控方法不能满足精细化研究需求的问题，开发了一个能够操纵精确位点甲基化的工具。该工具由保留RNA结合能力的失活Cas13b核酸内切酶（dCas13b）和甲基转移酶METTL14融合而成，可结合内源METTL3形成具有催化活性的异二聚体，在引导RNA（gRNA）的引导下将细胞中目标mRNA的特定m6A位点甲基化。我们构建了dCas13b-METTL14体外特异性甲基化的模型，确定了它的编辑窗口，并开发了精确识别甲基化酶作用位点的化学标记法，实现了对体外RNA模型的特异性甲基化的单碱基分辨率表征。基于体外模型的数据，我们搭建了体内特异性甲基化的模型，发现dCas13b-METTL14对内源METTL3/METTL14表达水平及m6A整体修饰水平几乎没有影响。我们开发了一个细胞全转录组单碱基分辨率m6A位点测定方法m6A-label-seq，并从m6A位点数据库中选取了几个特定的靶点进行细胞内甲基化调控。结果证明了该编辑工具的有效性，整个细胞甲基化组受到非常小的扰动，显示出很微小的脱靶效应。总之，我们成功开发了定点调控细胞内RNA m6A甲基化的方法，为将来研究RNA定点甲基化功能和甲基化相关疾病提供重要工具。我们完成了项目计划的研究目标，相关成果已在Nature Chemical Biology、Acta Biomaterialia、Current Opinion in Chemical Biology、STAR Protocols、Analytical Chemistry、Chemical Communications和Chembiochem上发表通讯论文，并申请了三项专利，其中一项已获得授权。