一个新的棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8的功能分析

Verticillium dahliae Kleb is the primary causative agent of Verticillium wilt disease, which seriously affects the cotton production in China. Indistinct pathogenic mechanism, delay of resistant breeding and lack of effective environmental friendly fungicide lead to difficult control of Verticillium wilt disease. .Transmission of Verticillium dahliae mainly relys on the microsclerotia and conidia. Fundmental research has been carried out to select the special mutant T286 from inserted mutant library of Verticillium dahliae Vd080. Compared to wild type, this mutant showed lower yield of conidia and weaker pathogenicity without microsclerotia producing. The gene inserted by T-DNA has been identified as glucose repression mediator protein CYC8, which was a novel critical pathogenicity related gene. In this project, the functional analysis involved pathogenicity, microsclerotia and conidia production of CYC8 will be conducted by gene knock out, complementation and overexpression. To clarify CYC8 expression characteristics in Verticillium dahliae, subcelluar location, temporal and spatial expression will be analyzed. This project means great significance on the better understanding of molecular pathogenic mechanism and effective control of Verticillium wilt disease.

棉花黄萎病是影响我国棉花生产的主要病害，其致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）。由于该病原菌的致病机理不清，抗病育种滞后，缺乏环境友好且防治效果好的杀菌剂，是棉花黄萎病防治难度大的主要原因。.棉花黄萎病菌的休眠体微菌核和分生孢子是病害传播的主要接种体，在前期的研究中，我们得到了一个不产微菌核和分生孢子产量骤减的低致病力突变体T286，将被插入的基因鉴定为glucose repression mediator protein CYC8，是一个重要的致病相关基因。本研究将分别通过敲除试验、互补试验和基因超表达手段，全面分析致病相关基因CYC8在致病性、控制微菌核产生和影响分生孢子产量方面的功能；通过对其表达产物的亚细胞定位和时空表达分析明确该基因的表达特征。该研究为揭示棉花黄萎病菌的分子致病机理提供理论依据，对有效防治该病害具有重要意义。

棉花黄萎病是影响我国棉花生产的主要病害，在植棉区广泛存在，是一种发病周期长，危害严重的维管束病害。其致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）变异频繁，休眠体微菌核抗逆性强，是对寄主再侵染的主要繁殖体。此外，病原菌环境适应性强，致病机理不清，没有特效的杀菌剂，抗病育种滞后，是该病防治难度大的主要原因。.本研究从菌核型强致病力棉花黄萎病菌Vd080的T-DNA突变体库中获得25株T-DNA单拷贝插入的低致病力突变体。与野生型菌株Vd080相比，这些突变体菌落形态变异丰富，多数突变体的生长速率、产孢量和粗毒素产量都发生了显著变化。借助TAIL-PCR技术和VdLs.17的基因组数据库，进一步获得了这25株单拷贝插入低致病力突变体T-DNA的侧翼序列，并从Vd080中成功克隆得到了影响黄萎病菌致病力的相关基因。.我们深入研究了生长速率显著降低分生孢子产量骤减、且不产微菌核的低致病力突变体T286。前期试验结果显示被T-DNA插入的基因为glucose repression mediator protein CYC8，在参照基因组数据库中的编号为VDAG_07052.1。我们从棉花黄萎病菌Vd080中克隆了该基因，命名为VdCYC8，并分别设计了敲除和互补实验，进行功能分析。结果显示，敲除突变体ΔCYC8完全丧失了产生微菌核的能力，产孢量和生长速率较野生型都极显著降低。致病力测定实验结果显示，敲除突变体较野生型发病延迟且症状轻微，在接种后24天，病情指数平均降低59.2%。互补转化子ΔCYC8-C的生物学性状呈现出不同程度的恢复，其致病力的强弱和VdCYC8的表达量呈正相关。结合荧光定量的手段，监测野生型、敲除转化子和互补转化子中菌核和黑色素产生相关基因的表达情况，结果显示，VdCYC8的有无直接影响着VDAG_00189, VDAG_00190, VDAG_03665和VDAG_03393的表达量，因此可以推测VdCYC8调控着部分微菌核产生相关基因的表达。综上所述，VdCYC8是棉花黄萎病菌中一个重要的致病基因，同时调控着微菌核产生、黑色素积累和产孢量等多种生物学指标。本研究为棉花黄萎病菌致病机理的阐明提供了理论基础。