基于重测序技术的转基因水稻分子特征分析及非预期效应评价

The transgene technique and its products are playing one important role in modern agriculture.The transgene integration and its biological effect are closely realted to the predicted argonmisis and safety of transgenic organisms.In this project, we want to use the massively parallel sequencing and mapping methods to characterize the transgene integration (Transgene locus, trangene locus site, flanking sequence, copy number of transgene loci,the exisitence of the backborn sequence,and the rearragment and deletion of rice genes close to the transgene locus, etc)and draw the transcriptome profile, analyze the different gene expression related to the transgene integration, and completely evaluate the intend and unintended effencts. The fruits of this project will throughly resolve the difficulty existed in transgene integration analysis for many years, and supply a new way for safety assessment of transgenic organisms.

转基因技术及其产品在现代农业生产中意义重大，转基因生物体外源基因整合和生物学效应直接关系到其农艺性状和安全性，因此对于外源基因整合及其生物学效应分析一直是转基因技术应用过程的关键数据。本课题旨在利用重测序技术，从全基因组水平分析转基因水稻外源基因的分子特征（转基因位点、旁侧序列、拷贝数、外源表达载体骨架序列插入、转基因位点相邻水稻基因组基因的重排和剪切等）及其非预期插入，转录组水平分析因外源基因整合引起的目的基因和受体基因的基因表达差异，全面的评估转基因水稻的预期和非预期生物学效应。研究成果将有效地解决长期以来转基因生物外源基因整合分子特征分析的难题，为转基因生物安全评价提供一种新思路。

本课题重点利用重测序技术，开发转基因水稻分子特征识别及其非预期效应的评价，主要开展重测序转基因水稻分子特征分析、分子特征检测新技术方法及其标准化验证三个方面的研究工作。提出了全基因组水平扫描分子特征的分析理论，构建paired-end（0.5-0.8 Kb）和mate-pair（~10 Kb）文库，对每个片段的5’端和3’端序列同时测序分析，建立了可全面、准确获得外源基因插入位点、旁侧序列、拷贝数和非预期插入等分子特征识别的分析模型TranSeq。利用该模型，揭示了我国自主研发的2种转基因水稻转基因转化体分子特征（外源基因整合片段、整合位点、拷贝数和非预期插入）。针对分子特征检测元件多的特点，建立了一系列快速、精确、高通量DNA检测新技术和新方法（如CALM、mDC-LAMP等），发明了基于体外等温扩增技术的闭管式可视化检测方法（vLAMP），肉眼观察反应前后的颜色变化实现可视化检测。结合核酸快速纯化装置，实现1小时内现场（无需离心机、PCR 仪等大型仪器设备）、可视化（肉眼观察，无需电泳、无反应后污染）检测。在此基础上，以主要转基因元件（CaMV35s、NOS、Bar、EPSPS、FMV35s）为对象，建立特异性vLAMP方法7种，组织了国内外同行实验室对研究建立的转基因产品检测新方法组织协同验证，证明其灵敏度、特异性和重复性均满足ISO国际标准要求，适用于转基因水稻等产品的分子特征检测。