苹果microRNA156及其SBP-Box靶基因调控株型和果实发育的机理与应用研究

本项目拟在苹果MiR156及其SBP-Box靶基因克隆的基础上，进一步研究它们对苹果株型、果实发育等重要性状的调控作用。首先采用PCR方法进行SBP-Box基因的人工突变，在不改变氨基酸序列的情况下破除miRNA剪切能力，同时设计miR156的target mimics以降低细胞中活性miR156积累量，将改造或合成的苹果SBP-box基因和miR156 target mimics转化番茄进行功能验证，筛选调控植物株型、童期、坐果量、果实大小和着色等性状的特异SBP-box靶基因，并用于转化苹果栽培品种'Gala'，开展苹果新种质的创制研究。与此同时，利用不同苹果种质资源，分析miR156和SBP-box基因的表达和序列差异与株型、果实大小、成熟期、果实着色之间的关联性，发掘控制苹果株型和果实发育等优良性状的分子标记，为苹果分子标记辅助育种提供改良工具。

苹果是一种重要的水果，在我国和全世界有广泛的种植。株型结构是果树、蔬菜、粮食和经济作物的重要农艺性状，决定着植物的栽培方式，影响着植物的光合效率和产品产量。miR156通过调控SBP-box转录因子调控植物的株型，成花，果实成熟等一系列重要的发育过程。本项目从苹果全基因组中鉴定出33个SBP-box家族基因，其中20个为miR156的靶基因。通过进化分析，对该家族成员进行了系统分类和功能预测。通过PCR检测，发现大部分预测的基因在富士苹果基因组中存在并表达，并且发现可变剪切在该家族基因中高频出现。根据表达分析和进化分析，在富士苹果中选择性克隆了4个代表性成员基因，即MdSPL2、 MdSPL11、MdSPL13 和MdSPL33。对这4个SBP-box基因进行人工修饰，通过靶位点剔除或密码子替换，在不改变蛋白编码的前提下对miR156识别位点碱基替换，使靶位点丧失功能。将经修饰的SBP-box基因转化番茄进行功能验证。发现1个载体的转基因番茄株型紧凑，节间缩短，植株矮化，同时，转基因植株果实萼片增厚并分组，但坐果正常，果实大小和产量不受影响。表明该基因是一个优良的株型调控基因。对3个转基因株系（L4，L16和L22）和3个对照株系（CK1，CK2和CK3）进行转录组测序。每个样品获得超过4G 有用数据。3个转基因株系与对照相比，分别有1091、655、1187个基因上调表达，1196、584、842个基因下调表达。其中333个基因在转基因和对照组间具有显著表达差异，其中248个基因上调表达，85个基因下调表达。表达模式聚类分析表明这些差异表达主要由外源基因引起。对差异表达基因的功能注释表明，该SBP-box基因是通过影响植物激素信号传导，进而影响植物代谢和次生代谢，从而调控植物株型结构以及其他发育过程。此外，收集了16个苹果近缘野生种，鉴定了7个品种的S基因型，并克隆了14个S-RNase基因。发现其中的两个S-RNase基因存在翻译提前终止现象。其它的12个S-RNase基因是调控花柱自交不亲和反应的决定基因。并对望山红与鸡冠杂交后代果实的各种生理性状进行了调查和鉴定，重新开发了500余种SSR标记，用以对苹果果实发育性状进行精细定位。本项目的结果为植物的株型改良和苹果分子育种提供了有用的理论依据、基因资源和分子标记。