家蚕微孢子虫活性非自主MITE元件的转座子起源及DNA甲基化转座调节作用研究

MITE是真菌中较罕见的非自主转座元件。本研究小组首次在家蚕微孢子虫中分离出了一个MITE元件（NbME5），建立了基于该元件的家蚕微孢子虫转座子展示技术，并发现NbME5在家蚕微孢子虫的体外细胞培养下呈现转座活性。据此，本项目拟结合家蚕微孢子虫和柞蚕微孢虫全基因组数据库，采用生物信息分析、昆虫细胞培养、Southern杂交进行NbME5在基因组上的关联性自主转座子鉴定及靶位点识别特征分析，研究NbME5在蚕微孢子虫中的转座子起源。采用转座子展示、甲基化敏感性多态性扩增、甲基化转座子展示以及亚硫酸氢钠测序技术进行家蚕微孢子虫全基因组、NbME5转座位点以及转座位点侧翼区的DNA胞嘧啶甲基化变化对MITE转座活性的影响情况分析，获得DNA甲基化对NbME5活性的调节信息。本课题的实施，为揭示家蚕微孢子虫MITE元件的转座原理及转座调控机制奠定基础，并为微孢子虫转基因技术的开展提供理论依据。

转座子是导致家蚕微孢子虫基因组膨胀的主要因素之一，但关于其进化历程，转座活性以及潜在调控机制还一无所知。本项目以研究家蚕微孢子虫MITEs转座子为入手点进行了以上问题的相关研究。我们开展了柞蚕微孢子虫的全基因组测序，在此基础上完成家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫全基因组中MITEs家族的全面鉴定，分别获得了89和16个家族，它们分属于Stowaway-like、Tourist-like、hAT-like、Merlin-like、Mutator-like等超家族中，并分析了这些MITEs家族的转座识别位点。完成了家蚕微孢子虫与其它近缘微孢子虫不同MITEs转座子的进化历程比较，例如发现一个MITE家族NBh2在家蚕微孢子虫基因组中发生了两次规模性爆发。研究了MITEs对基因结构的影响,发现它们是导致家蚕微孢子虫基因长度变大的因素之一，并探讨了它们的起源。从已鉴定到的所有MITEs家族中，通过基于转座子插入片段的特异PCR扩增技术筛选到两个家族NbS31和NbS24在不同家蚕微孢子虫不同的地理株系中的插入有多样性，表明它们是新插入到特定的基因组区域，暗示这两个MITEs家族具有潜在的转座活性。以这两个家族为靶标，采用MS-PCR（甲基化特异PCR技术）分析它们在基因组插入位点附近的序列甲基化情况，初步发现家蚕微孢子虫重庆株的NbS31在插入到基因组区域附近无甲基化的现象，而没有NbS31插入的区域则有甲基化，暗示MITEs的插入可能与侧翼区域的甲基化有关联。基于small RNAs的全基因组测序，发现了大量与家蚕微孢子虫MITEs相匹配的sRNAs, 这些sRNA的存在是否参与了MITEs的转座活性调节，为后继进一步研究提供了潜在的线索。