用单分子方法研究G-四链体DNA结构稳定性和解旋机制

In the chromosome, there are some guanine rich regions. These guanines form G-tetrad by the hoogsteen hydrogen bonds, and then fold into G-quadruplex stabilized by monovalent ion such as K+, Na+. At the end of human chromosome telomere, there is a single strand repeated sequence GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG of ~200nt, which is able to fold into G-quadruplex and block the telomerase elongation of telomere DNA. Besides, G4 sequences were also identified to exist inside genome, especially in promoter region. By switching between folded and unfolded states, those sequences are able to regulate gene transcription and expression. However, until now, there is a lack of deep understanding of G-quadruplex physical properties such as folding pathway and structural fluctuations. The investigation of G-quadruplex unwinding mechanism by helicase has just started recently. We are going to use single molecule methods including magnetic tweezers and single molecule FRET to study: (1) the physical basis for G-quadruplex stability: folding pathway, higher structure formation mechanism and the effects of sequence on the structure； (2) G-quadruplex unwinding mechanism, including helicase assembly state, G-quadruplex intermediate state, unwinding velocity, efficiency, step size, processivity. The answers to those questions will provide deep understanding of the biological functions of G-quadruplex, and benefit the G-quadruplex targeted anti-cancer drug design.

染色体中存在一些富含鸟嘌呤的区域，鸟嘌呤在hoogsteen氢键和一价阳离子作用下堆积成稳定的G－四链体（G4）。人类染色体端粒带有～200nt的GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG重复序列，通过折叠成稳定的G4结构抑制端粒酶工作，来调控端粒延伸。 G4序列也存在于基因启动子区域，通过折叠／去折叠的转换对基因转录表达进行调控。G4结构由于对端粒和基因表达的调控作用，已经成为十分重要的抗癌药物设计靶点。遗憾的是，人们对G4折叠路径，结构热涨落等物理性质还缺乏深入了解，对G4结构解旋机理的研究更是刚刚起步。我们将借助先进的单分子生物物理手段（包括磁镊和单分子荧光共振能量转移）来研究：(1) G4 DNA稳定性的物理学基础，包括折叠路径、高级结构形成机制、序列对结构的影响等；(2) G4 解旋微观机制，包括解旋酶聚集状态、解旋方向、是否存在中间过程、解旋速率、解旋效率、步长、持续解旋距离等

G-四链体DNA是由富含鸟嘌呤的DNA序列折叠成的具有四条链的高级致密核酸结构。G4 DNA广泛存在于基因启动子和染色体端粒，对G4 DNA调控机理的认识将有助于我们对癌症和衰老现象的理解。在本项目中，我们借助先进的单分子生物物理手段，首先研究了G4 DNA结构在外力作用下的折叠和去折叠动力学。该研究清晰表明G-triplex是G4折叠和去折叠路径中必然要经历的中间态，由此结束了关于G4折叠路径的争议。我们还用单分子FRET证实了G4折叠中间态G-triplex和G-hairpin的存在，并系统研究了这些中间结构的动态折叠过程。紧接着，我们对于几类重要G4 DNA解旋酶的微观工作机制进行了深入研究，包括以下内容：1) Pif1以分步解旋和重复解旋的方式将G4打开，这样的循环解旋方式为聚合酶顺利通过G4障碍提供了更多机会。此外，我们研究了Pif1在解旋G4与双链DNA机制上的差异，并发现G4结构或G-rich序列能够大大激活Pif1的解旋活力；2) 研究了BLM解旋酶对G4 DNA的作用机理，发现G4结构所处的DNA环境对BLM的解旋方式具有重要调控作用；3) 研究了WRN解旋酶对包括单链、双链、G4等不同DNA结构的作用机理，发现WRN能够铆定在单双链岔口循环拉动单链，从而反复将单链末端的双链或G4打开；4) 研究了e.coli RecQ 解旋酶对G4 DNA的作用机理，发现RecQ重复解旋G4结构，然而G4结构的存在对RecQ继续解旋下游双链造成严重障碍。本项目的实施，不仅深化了人们对于G4结构的物理学基础和生物学功能的理解，并且对推动以G4为靶点的抗癌药物设计具有重要意义。