基于ADSC-EV血管诱导型3D打印仿生支架的 “后植法”乳房组织工程策略与机制研究

It is widely acknowledged that breast tissue engineering has broad application prospects in breast reconstruction after radical mastectomy. However, the bottleneck of its clinical treatment translation is the insufficient of grafts` vascularization, adipogenic microenvironment and adequate scaffold design for soft tissue, resulting in the difficulties in the reconstruction of large-size breast shaped graft in vivo. Our previous reseaches have demonstrated that human adipose derived stem cells- extracelluar vesicles(ADSC-EV) were capable in angiogenesis and improving fat survival rates. Meanwhile, we have developed a novel ADSC-EV surface modification strategy. Based on all mentioned pre-studies, the applicant for the first time supposed the “delayed implant” breat tissue engineering strategy with ADSC-EV modified 3D printing biomimetic scaffolds. Firstly, with the aid of CAD design and 3D printing technology, print a breast shaped PCL scaffold which is dual-biomimetic in shape and biomechanical property. Secondly, use ADSC-EV to modify this scaffold,and then subcutaneously implant it into nude mice for pre-vascularization. In accordance with the growing extent of neo-vessels and the decrease of inflammatory response, inject the ADSC-EV mixed fat grafts into the breast scaffold with multi-point injective methods, to reconstruct large-size breast shape grafts in vivo. We shall compare this novel strategy with tradiational tissue engineering method, for the purpose of determine its feasibility and priority. Finally we shall study the potential mechanism from the aspects of implanted ADSCs` survival and fate, in order to accelerate the clinical translation of breast tissue engineering.

利用乳房组织工程技术进行乳腺癌术后乳房再造具有较广阔的应用前景，但其临床转化瓶颈在于血管化不足及缺乏适合的软组织工程支架，导致大体积移植物体内构建困难。我们前期研究发现人脂肪干细胞来源胞外囊泡（ADSC-EV）可促进血管新生与颗粒脂肪存活，并已成功建立了基于ADSC-EV的支架表面修饰技术。基于此,申请人首次提出了基于ADSC-EV血管诱导型仿生支架的“后植法”乳房组织工程重建策略：首先通过CAD设计与3D打印技术制备生物力学与外型双重仿生的多孔聚己内酯乳房形态支架，再使用人ADSC-EV进行表面修饰后植入裸鼠皮下进行预血管化处理，随后将ADSC-EV与人颗粒脂肪混合物多点注射至支架内部，借助预构的血管化微环境构建大体积乳房形态移植物。我们将通过对比传统乳房组织工程策略，验证该策略的可行性与临床转化优越性，并从脂肪干细胞存活与命运转归的角度研究其机制，为乳房组织工程技术的临床转化提供新思路

本项目研究内容包括如下三个部分：第一部分 ：缺氧诱导因子稳定剂 FG- -2 4592 促进组织工程 乳房 血管化的研究。在体外通过划痕试验、成管试验、qRT-PCR 以及 Western Blot 观察含有 FG-4592 的培养基对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移、成管、HIF-1α及其下游 VEGF 表达的影响，以及对 RAW264.7细胞系炎症因子分泌的影响；在大鼠皮下构建乳房组织工程室模型，在组织工程室内用 Fibrin 凝胶对 FG-4592 进行负载，3、7、14 天后取材，通过 HE 染色、免疫组化染色观察 FG-4592 在体内对氧感知通路和组织工程血管化进程的影响。第二部分： 类晶体结构力学仿生组织工程乳房支架的设计、构建 和应用。通过 UG、Magics 等三维建模软件进行乳房支架的类晶体结构设计；通过熔融沉积 3D 打印技术、利用聚氨酯（PU）打印材料制备乳房支架；通过 Micro-CT、电子万能试验机对支架进行结构和力学表征；筛选出弹性模量与天然乳房最接近的支架作为实验组、差别最大的作为对照组，埋置于裸大鼠背部皮下，两周后进行延迟脂肪注射，构建组织工程乳房；饲养三个月之后进行核磁共振检测、血管灌注成像以及组织学检测，评估组织工程乳房构建效果。第三部分： 石墨烯功能化光热 肿瘤杀伤型乳房支架的构建和应用。通过不同浓度的石墨烯悬液对乳房支架进行表面修饰，形成肿瘤杀伤型乳房支架；通过细胞和动物实验评价支架的生物相容性；体外通过检测 808nm 激光照射下支架的温度变化评价其光热效应；通过体外肿瘤细胞杀伤实验和体内乳腺癌复发抑制实验评价该支架的光热效应肿瘤细胞杀伤和乳腺癌复发预防效果。综合运用本研究中的促血管化、力学仿生以及光热肿瘤治疗等手段，有望提升组织工程用于乳癌术后乳房重建的效果。