性激素对人工繁育扬子鳄性别分化的影响机理

In this project, we plan to investigate the embryonic gonads of the Chinese alligator hatched under MPT and FPT by using ultrastructure, immunohistochemistry, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and RNA-Seq techniques. The gonad samples were collected during various period of embryonic development, and then we analyze the distribution, quantitative expression of ERα and ERβ, AR，PR，LHR，FSHR and GnRHR receptors for each temperature conditions, and also analyze the Gene regulatory network of sex determination. This project will present more knowledge of early embryonic development and sex differentiation. The researches are try to (1) to determine the time of Female and male gonads and the change of gonads of the Chinese alligator; (2) to research the distribution and location of sex hormone receptors; (3) to study the gene expression of various sex hormone receptors during the period of differentiation gonads and sex differentiation; (4) to analyze and identify the new candidate genes and gene regulatory networks related with sex determination of the Chinese alligator.　The results will promote to make understanding of early gonads developmental process of the Chinese alligator and the potential molecular mechanism of TSD species, and meanwhile, provide the scientific basis for controlling the sex ratio of captive population by artifitial breeding.

本研究采用显微和超微结构分析、免疫组织化学、实时荧光定量PCR、转录组测序等技术，研究MPT和FPT条件下扬子鳄胚胎性腺发育不同时期雌激素受体(ERα和ERβ)、雄激素受体 (AR)、孕激素受体(PR)、黄体生成激素(LHR)、卵泡刺激素(FSHR)和促性腺激素释放激素受体( GnRHR)等的定位、基因定量表达及基因调控网络分析。研究内容:(1)确定胚胎发育过程中，雌性和雄性性腺出现分化的具体时间及性腺的结构变化;(2)研究不同的性激素受体在性腺发育及性别分化过程中出现的时间、分布与定位;(3)探讨不同性激素受体基因在性腺发育及性别分化过程中基因表达调控;(4)分析、鉴定与扬子鳄性别决定相关的新候选基因，分析扬子鳄性别分化相关基因调控网络。本研究结果将加深人们对扬子鳄早期精巢或卵巢发育进程的了解，深入理解TSD物种性别分化潜在的分子机制，并为人工繁育调节扬子鳄饲养种群性比提供科学依据。

本项目基于转录组测序及组织形态学证据探究了扬子鳄胚胎在不同孵化温度条件下的形态学层面和基因组学层面的性腺分化时间节点；分别筛选了扬子鳄雌雄性腺分化及发育过程中的关键差异基因及功能富集通路。开展了雌激素核受体及膜受体在雌性扬子鳄性腺组织中的时空表达定位及Cis转录调控机制等相关研究，结合促性腺释放激素及其受体、促性腺激素及其受体在胚胎期及初生期扬子鳄脑和性腺组织中的时空变化规律系统探讨了性激素信号通路在扬子鳄性腺分化及形成过程中的调控机制。相关结果表明：基于上述不同孵化温度扬子鳄性腺组织发育过程中的组织形态学染色观察，初步判断FPT和MPT性腺组织具备性二态特征的孵化时间节点分别为胚胎期第36天和33天；在对性腺分化过程中性激素信号分子的研究表明，雌激素核受体ESR1在雌性扬子鳄性腺分化及早期发育过程中广泛表达于卵巢组织生殖细胞和其他基质细胞内，但其表达量在性腺形成与发育过程中始终处于稳定表达，但未在雌性性腺分化节点前后并不存在显著的变化，提示其可能作为性腺形成过程中的关键转录因子发挥作用，随着雌性扬子鳄性腺形成及发育，雌激素膜受体GPER1基因的转录和翻译水平均显著上调，提示其介导的雌激素效应可能在扬子鳄性腺分化及早期发育过程中发挥重要功能。雄性性腺分化E19天和E33天的KEGG分析富集了319条通路，其中有168个差异基因富集于Metabolic pathways通路；25个差异基因富集于Arachidonic acid metabolism通路；20个差异基因富集于Ether lipid metabolism通路，雌性性腺分化E22天和E43天的KEGG分析富集了315条通路，其中有153个差异基因富集于Metabolic pathways通路；32个差异基因富集于cAMP signaling pathway通路；15个差异基因富集于PPAR signaling pathway通路，上述性腺分化过程中差异基因的初步筛选为进一步探究扬子鳄性腺分化的分子驱动机制奠定了研究基础。