枸杞多糖改善早老性Immp2l突变小鼠生精功能及相关机制的研究

Lycium barbarum polysaccharide (LBP) is reported to decrease the OS level and protect male fertility. However it still remains controversial about whether LBP is as effective as it is expected and how it functions. A major challenge is that we lack suitable animal models to evaluate the possible effects of LBP. Our group generated Immp2l mutant mice showing oxidative stress without the need of physical or chemical damages. Male mutant mice show impaired spermatogenesis after the age of 11 months, and treating the mutant mice with mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 improves spermatogenesis in mutant mice, and increase the expression of antioxidant enzyme GPX4. This project will use Immp2l mutant mice as an animal model, wherein they will be treated with high and low dosage of LBP from 1.5 and 11 months, and treated with the mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 as positive controls. We will examine the OS level, the expression of GPX4/AIF(Apoptosis inducing factor) apoptosis pathway, germ cell apoptosis at different stages of spermatogenesis, quantity and quality of spermatozoa with technologies such as ELISA, Western blot and TUNEL. We will evaluate the antioxidant effect of LBP delivered before and after spermatogenic damage, and determine whether LBP can improve spermatogenesis and sperm quality of mutant mice, and elucidate the underlying mechanism. We believe that this project will provide in vivo evidence and scientific rationale for the practice of using LBP to improve fertility.

枸杞多糖（LBP）可降低氧化应激（OS）水平，对雄性生殖细胞有一定保护作用，但LBP的抗氧化作用及机制缺乏明确体内证据。项目组已建立的线粒体内膜肽酶基因（Immp2l）突变早老小鼠模型，未经理化损伤呈现OS状态，精子生成自11月龄受损；线粒体靶向抗氧化剂SkQ1治疗可改善精子生成，并提高抗氧化酶GPX4表达。本项目以Immp2l突变小鼠为模型，自1.5、11月龄行高、低剂量LBP治疗，以SkQ1为阳性对照，借助ELISA、Western blot 及TUNEL双标等技术检测OS水平、GPX4/凋亡诱导因子（AIF）通路表达、生殖细胞凋亡及精子参数等指标，评估LBP自早期（生精受损前）和晚期（受损后）开始治疗的抗氧化效果，阐明LBP是否对精子发生和成熟精子质量起保护作用，论证LBP如何上调GPX4、阻止AIF进入细胞核启动凋亡。该研究将为枸杞改善生殖的中医实践提供坚实的体内证据和科学依据。

背景 枸杞多糖（LBP）可降低氧化应激（OS）水平，对雄性生殖细胞有一定保护作用，但抗氧化作用及机制缺乏明确体内证据。项目组已建立的Immp2l突变早老小鼠模型，未经理化损伤呈现高OS状态，证实线粒体能量代谢及膜电位没有没变，精子生成自11月龄受损，为开展本研究提供了很好的OS模型。方法 本项目首先以Immp2l+/-小鼠为模型，给予2%酒精4个月饮水喂养为阳性对照组，10mg/kg、20mg/kg及40mg/kg LBP干预；又Immp2l-/-小鼠为模型，自1.5、11月龄行20mg/kg、40mg/kg及80mg/kg LBP干预治疗；借助HE、电镜技术及TUNEL检测形态学变化及凋亡情况，利用ELISA、比色法检测铁离子、蛋白羰基、MDA及总抗氧化能力，蛋白质谱、Western blot、免疫组化及RT-PCR检测差异蛋白表达及转录水平变化；根据不同的动物模型及用药情况，构建TM3细胞模型进行体外验证。结果 ① 10mg/kg LBP通过影响Immp2l+/-生精上皮Col1a1、Col1a2表达，调控精子发生过程中TNP2及RPL31水平，保护慢性和低剂量乙醇对害雄性生殖功能受损；②自1.5个月给予LBP饮水喂养 ，20mg/kg改善Immp2l-/-小鼠睾丸生精损伤，细胞学结果显示LBP通过增加 GPx4、降低 AIF 表达并抑制其核转移对 O-TM3 细胞进行抗氧化作用；③ 自11月龄给小鼠灌胃干预，40mg/kg LBP对生殖损伤具有显著改善作用，上调GPX4、ACSL4、FTMT，下调SAT1等蛋白表达；RSL3抑制GPX4活性进行体外验证。结论 ① 10mg/kg LBP通过影响Immp2l+/-生精上皮状态调控精子发生过程中蛋白表达，保护慢性和低剂量乙醇对雄性生殖功能受损；②自1.5月龄长期大剂量LBP干预效果不佳，20mg/kg LBP可能通过GPX4-AIF通路改善Immp2l-/-小鼠睾丸生精损伤；③ 40mg/kg LBP晚期灌胃治疗效果较好，激活GPX4表达，调控铁离子水平及脂质氧化物代谢过程，阻止铁死亡的发生。通过构建三种OS模型，利用高、中及低剂量LBP干预，全面阐述LBP保护os致生精功能障碍及精子质量下降的情况及机理，该研究将为枸杞改善生殖的中医实践提供坚实的体内证据和科学依据。