新型肿瘤血管靶向性栓塞体系的建立及其抗肿瘤作用

选择性肿瘤血管血栓栓塞是一种新颖的肿瘤血管靶向治疗，但目前在以截短组织因子（truncated Tissue Factor-tTF，也称前体凝血酶）为效应因子的研究中，存在tTF在靶点富集度低、单体活化凝血因子X能力弱等缺点。为克服这些问题，本课题在传统的单一载体与效应因子结合中引入Streptavidin（SA）和Biotin(B)放大系统，籍此克服上述缺点。实验选择以前期发展的肿瘤新生血管靶标Integrin ανβ3）的高效多肽配体M7为载体，通过基因工程技术制备M7-SA融合蛋白、化学交联技术合成tTF-B交联物。通过联合应用M7-SA和tTF-B，以建立一种新型的肿瘤血管靶向性的血栓栓塞反应体系。在体外，检测新体系在靶点的富集效率、凝血促发能力；在体内，免疫组化技术等观测其选择性诱发肿瘤血管血栓栓塞的活性和抗肿瘤效果，并探讨它们的作用机制。

选择性血栓栓塞肿瘤血管以阻断肿瘤细胞的血供，是一种非常有潜力的抗肿瘤策略。该策略以截短的组织因子tTF为效应因子，肿瘤新生血管标志物配体为靶向载体，构建载体与tTF的融合蛋白，以选择性诱发肿瘤血管栓塞。但是，传统的tTF融合蛋白存在靶点富集率低、活化FX能力弱等问题。为了克服这些缺点，我们提出以整合素(ανβ3) 的配体M7.1为载体、tTF为效应因子，同时联合Streptavidin/Biotin(SA/B)系统，建立一种新型的选择性诱发肿瘤血管血栓栓塞体系的设想。. 本研究利用基因工程技术与化学交联技术分别制备了M7.1-Streptavidin (M7.1-SA) 融合蛋白 、Biotin-tTF(B-tTF) 交联物及M7.1-tTF等对照物。共聚焦荧光显微镜和竞争抑制ELISA技术分别证明了M7.1-SA保持M7.1与受体的结合能力和SA组分的活性；SA-HRP酶活力分析、FX活化分析及体外凝血实验分别显示B-tTF保留有Biotin组分和tTF组分的活性。利用荧光显微镜与光学显微镜同时观察M7.1-SA/B-tTF体系与靶点的结合能力和凝血效果，结果显示复合体系凝血效果强于单体融合蛋白M7.1-tTF或SP5.2-tTF，凝血反应强度与载体的结合能力和定位分布相关。主要器官成像及肿瘤组织免疫荧光分析显示相对于M7.1-tTF对照组，M7.1-SA/B-tTF体系能够更有效地定位于肿瘤血管并选择性诱发血栓栓塞。H22荷瘤小鼠体内的初步药代动力学结果显示，给药后8-12小时内M7.1-SA在肿瘤组织分布最高且下降缓慢，提示给药8-12h是应用B-tTF的时间窗。在鼠肝癌H22模型、鼠肉瘤S180模型和人胃癌MGC-803裸鼠模型的治疗实验中，结果显示M7.1-SA/B-tTF组的抑瘤率分别为71.6%、70.7% 和65% (p<0.01)，均显著高于M7.1-tTF、tTF-EG3287和SP5.2-tTF等对照组。组织病理学观察结果表明M7.1-SA/B-tTF组的肿瘤血管血栓栓塞更多、更完全，肿瘤细胞缺血性变性坏死更明显，这与其肿瘤生长抑制效果表现一致。. 总的来说，我们首次利用SA/B放大系统成功建立了一种新型的肿瘤血管靶向性血栓栓塞体系并阐明其抗肿瘤机制，创新性地发展了肿瘤血管靶向性血栓栓塞的治疗策略。