慢病毒载体介导的LMP-1/HIF-1α修饰的脂肪源性干细胞高效定向成骨分化的实验研究

While the strategy of bone tissue engineering combined with gene therapy has been the new research fields in the healing of athletes' bone fracture, the greatest challenge is seeking for an effective seed cell and suitable genes to enhance the healing of fracture. LIM mineralization protein-1 (LMP-1) is a novel intracellular osteogenic factor associated with bone development that likely acts through multiple BMP-dependent and -independent mechanisms to effectively promote osteogenic differentiation of stem cells and fracture repair. Hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a), which activates the transcription of target genes in response to reduced O2 availability after fracture, is known to activate the transcription of many angiogenic genes, including VEGF, Ang-2, etc. So HIF-1a should have more advantages in promoting angiogenesis compared with the single gene therapies. Osteogenesis and angiogenesis are tightly coupled during bone development and regeneration. Therefore, in our study, we choose adipose-derived stem cells (ASCs) that could be easily obtained via minimally invasive surgical technology as seed cell. And using Lentivirus-based gene therapy with LMP-1 and HIF-1a to enhance osteogeic differentiation of ASCs. Then we also observe the in vivo results of fracture healing combined the modified ASCs and bioscaffold. The findings would suggest that this method may potentially be a simple and effective means to enhance fracture repair for athletes.

骨组织工程技术结合基因治疗的发展为运动员骨折的临床修复开拓了新的研究领域，但选择何种目的基因及细胞载体可满足运动性骨折高效修复的诉求成为关注重点。LMP-1是一种具有高效成骨特性的胞内蛋白，可通过瀑布效应和级联反应，诱导包括数型骨形态发生蛋白（BMPs）等多种成骨因子的产生，高效调控干细胞向成骨细胞分化；低氧诱导因子-1α (HIF-1α)是骨折后局部血流下降造就低氧环境所诱导产生的转录因子，可促进血管内皮生长因子（VEGF）等多个生长因子表达，促进类生理状态的血管再生，高活性诱导骨折部位血管形成。骨与血供的联合重建可加快骨愈合速度，因此本研究选择符合运动员微创要求且易扩增的脂肪源性干细胞（ASCs）作为载体细胞，应用高效的慢病毒载体将LMP-1和HIF-1α双基因联合导入，探讨二者对ASCs成骨分化的影响，并与支架材料结合，在体观察骨愈合效果，为促进运动员高效骨修复提供一个更好的方法。

伴随体育运动激烈程度的增加，无论是高能量创伤导致的骨折或者是运动疲劳导致的“应力性骨折”的发生愈发常见。尽管临床实践中这两类骨折的治疗方式多样且大都具有良好的效果，但实际上运动员往往由于重返赛场的迫切诉求使得二者易发展为骨延迟愈合甚至骨不连。结合运动员对于愈合时间的要求以及训练的实际需要，加速运动员骨组织的修复与重建，申请人于2013年在国家自然科学基金青年项目资助下按照任务书的要求和时间点分别开展了下列研究：（1）研究了LMP-1慢病毒表达载体的构建包装以及HIF-1α慢病毒载体的构建包装，寻求到最佳的构建包装方式；（2）通过将携带两个目的基因的慢病毒载体分别载入大鼠脂肪干细胞（ADSC），体内外观测其对ADSC的成骨分化的诱导作用；（3）通过将载入目的基因的ADSC与生物材料复合，植入小鼠股骨干骨缺损，术后4、8、12周分别对缺损处进行组织学、影像学等检测，对其促进骨愈合效果进行评估，进一步确定LMP-1/HIF-1a双基因可有效促进骨缺损的愈合。本课题的创新性在于（1）本研究结合运动性骨损伤愈合的实际要求，使用对机体创伤较小、来源丰富，且数量可靠的具有多向分化能力的脂肪源性干细胞作为目的细胞，应用慢病毒载体介导LMP-1和HIF-1α双基因共转染,促进脂肪源性干细胞向成骨细胞分化，并结合三维生物材料，促进骨修复。（2）以高效的慢病毒载体介导骨重建过程中骨再生及血管形成的过程，通过上游胞内因子LMP-1和HIF-1α基因的转入，受损伤部位周围各种因素的影响更小。通过调控下游靶基因的表达，可持续保持能够促进骨折愈合的有效生理浓度，作用强度更大，进而高效促进种子细胞成骨分化及血管再生，为加速运动性骨损伤的修复提供了新的有效治疗策略。研究进展较为顺利，按照任务书要求完成所有研究内容。发表SCI文章1篇和中文论著2篇，培养在读研究生1名。本研究的顺利进行和结题，为促进运动性骨折愈合提供了更为有效的新策略和新方法。