miR156-targeted PvSPL转录因子调控柳枝稷分蘖发育的分子机制

Switchgrass (Panicum virgatum L.) is a tall growing perennial C4 grass with multiple tillers, which can provide excellent forage for cattle and substantial feedstock for biofuel production. Genetic engineering for achieving high biomass of forage and energy crops has received more attention in switchgrass molecular breeding programs. The SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) transcription factors, as the targets of miR156, can change plant architecture, growth, and development significantly, and as such, they are promising candidates for genetic improvement of switchgrass biomass yield. However, the genome-wide identification and functional characterization of SPL genes have yet to be investigated in herbaceous forage and energy crops. Here, we propose to discover the biological functions of miR156-targed PvSPLs in three different subfamilies in switchgrass. Based on the functional characterization of these PvSPLs, we will identify the crucial PvSPL which regulates tiller development in switchgrass. Furthermore, we will analyze the transcriptome of the transgenic switchgrass plants with altered PvSPL expression levels to seek the candidates of PvSPL-targeted genes. Moreover, we will explore the protein factors which can interact with PvSPL by yeast two-hybrid screening. Finally, we will study the functions of the particial PvSPL targets and interaction factors in switchgrass, and their effects on the roles of PvSPL involved in tiller development as well. Our project will lead to important strategies for developing novel germplasms of herbaceous forage, bioenergy grass, and other monocot crops with high biomass yield in future.

多年生禾本科牧草和能源草分蘖发育的调控机制，目前尚不清楚，从而制约了这些重要经济作物高生物量品种的定向培育。柳枝稷是多年生多分蘖禾本科草本植物，同时也是牧草和能源草双用作物。SPL转录因子是miR156在植物中的靶基因，能够控制植物的株型和生物量。因此本项目计划在柳枝稷中全面鉴定不同亚家族miR156-targeted PvSPLs的生物学功能，从而确定影响分蘖发育的关键PvSPL。在此基础上，通过转基因柳枝稷的转录组分析，筛选该PvSPL的潜在靶基因。同时，使用酵母双杂交技术筛选能够与PvSPL相互作用的蛋白因子。最后，通过我们特色的高效遗传转化和多基因共调控技术，在柳枝稷中鉴定部分备选靶基因和互作蛋白基因在分蘖发育中的作用及其对PvSPL功能发挥的影响。从而解析PvSPL控制分蘖发育增加生物量的分子机制，为今后分子设计创制高生物量牧草和能源草种质资源，提供新的策略。

柳枝稷是多年生多分蘖禾本科草本植物，同时也是重要的牧草和能源草双用作物。然而柳枝稷分蘖发育的调控机制，目前尚不清楚，从而制约了高生物量柳枝稷品种的定向培育。本项目在柳枝稷中全面鉴定了miR156靶向的三个PvSPL亚家族代表成员SPL2、SPL4、SPL6的生物学功能，从而确定影响分蘖发育的关键PvSPL。我们分别产生了PvSPL2、4和6的过量表达、RNAi和SRDX抑制的转基因柳枝稷植株，表型分析结果表明，miR156靶向的转录因子PvSPL2、4和6参与调控柳枝稷茎秆粗细、分蘖数以及开花时间。在此基础上，通过转基因柳枝稷的转录组分析、酵母双杂交文库筛选以及转基因柳枝稷功能验证，鉴定获得了4个受PvSPL2，4和6调控的潜在靶基因（PvCKX4、PvLOB）和1个与PvSPL2和4转录因子互作的蛋白（PvFLCL），这些靶基因与蛋白互作因子涉及到植物激素细胞分裂素、独脚金内酯合成酶以及开花抑制。进一步分析发现，PvSPL2的功能较为广泛，既可以作为转录抑制子，抑制细胞分裂素氧化酶基因PvCKX4的表达从而调控柳枝稷茎秆粗细，也可以作为转录激活子，激活独脚金内酯合成酶基因PvLBO的表达，从而调控柳枝稷分蘖数。PvSPL4则潜在通过抑制侧芽相关激活子PvLAX1以及PvMOC1的表达调控柳枝稷分蘖及侧芽发生。而PvSPL6作为柳枝稷营养生长到生殖生长转变的关键因子，通过调控MADS类开花因子的表达，影响柳枝稷开花时间。另外，PvSPL6还能够与PvSPL2和4互作，进而以复合体形式结合开花抑制蛋白PvFLCL，从而影响柳枝稷分蘖数、开花时间及生物量。在对miR156靶向的不同PvSPL亚家族成员及其下游靶基因与SPL互作因子功能解析的基础上，进一步通过分子设计将柳枝稷的生物量提高了200%。通过本项目研究，不但产生了多个具有潜在应用价值的高生物量柳枝稷种质新资源，还为今后能源草与牧草生物量的分子设计与改良提供了更多更新的靶位点。