PvSPL6/8调控柳枝稷开花时间的分子机制研究

Flowering time can impact plant biomass by manipulating the vegetative-reproductive balance in horticultural crops through nutrition. The miR156-SPL pathway plays a key role in regulating plant development and floral transition. We found miR156-overexpressing transgenic plants greatly delayed flowering time in switchgrass. We characterized several miR156-targeted SPL genes. Overexpression PvSPL6 and PvSPL8 significantly improved the flowering of switchgrass, while down-regulating PvSPL6 and PvSPL8 through RNAi delayed the flowering. To elucidate the molecular mechanism of PvSPL6 and PvSPL8 regulating flowering time, Yeast two hybrid, BiFC, and CoIP will be utilized together to analysis the protein interaction network of SPL6 and SPL8 in this project. And we will use RNA-seq to identify the candidate targeted genes of PvSPL6/8. EMSA, ChIP-PCR, and In vitro transcription activity assay will be used to confirm the interaction between PvSPL6/8 and their targeted genes. This project can help us to understand the balancing between vegetative and reproductive development of switchgrass and to provide more targeted genes used for genetic and molecular breeding of switchgrass biomass improvement.

开花时间影响物质和能量在营养体与生殖器官中的再分配，从而对植物的生物量具有显著影响。miR156-SPL是控制植物器官发育和生长时期转变的一个关键途径。我们的前期研究表明，在重要的能源和牧草双用作物——柳枝稷中过表达miR156能够抑制开花。在此基础上我们分离鉴定了多个miR156的靶SPL。其中，过表达PvSPL6和PvSPL8可以显著促进柳枝稷早花，而RNAi之后的植株表现为晚花。为了阐释PvSPL6和PvSPL8调控柳枝稷开花时间的分子机制，项目将通过酵母双杂交、BiFC和CoIP等手段解析柳枝稷SPL6/8的蛋白互作网络。利用RNA-seq差异表达谱分析寻找其可能的靶基因，并利用EMSA、ChIP-PCR和体外转录激活实验等手段对候选靶基因进行验证。项目有助于解析柳枝稷营养和生殖生长的平衡，为今后柳枝稷生物量的遗传改良和分子设计提供更多的靶位点。

开花时间、分蘖数目、茎秆粗细、植株高度都是影响能源草生物量的重要性状，其中开花时间具有决定性作用。延迟开花时间是增加能源草生物量的有效途径，miR156-SPL模块是调控花期过渡的关键因子。然而由于禾本科能源草开花调控网络较为复杂，目前关于SPLs 如何参与其开花调控的分子机制仍然不完善。对此，本研究基于过表达miR156具有延迟柳枝稷开花时间的表型，初步确定柳枝稷中PvSPL6/8作为拟南芥开花调控因子AtSPL3/4/5的同源基因，具有调控柳枝稷开花时间的潜能。本项目利用转基因、转录组测序、酵母文库筛选等分子生物学技术深入研究了PvSPL6/8的生物学功能及其调控机制。结果证实，PvSPL6/8在调控柳枝稷开花时间上具有决定性作用，并且通过蛋白互作及对下游开花因子的转录激活实现对开花时间的调控。转录水平上，PvSPL6/8能够通过直接结合MADS5/32的启动子区，激活其表达进而促进柳枝稷开花。蛋白水平上，PvSPL6/8能够通过与其他亚家族的PvSPL2/4互作借用其蛋白功能域结合开花抑制因子PvSOK2形成复合体，从而影响柳枝稷开花时间。此外，本研究首次发现PvSPL6/8基因存在核膜双重定位。经研究确定，赤霉素（GA3）是影响其核膜定位的重要因子，且GA3处理能够抑制 PvSPL6 对下游靶基因的转录调控作用。对此，我们推测PvSPL6转录因子在接收到GA途径中某蛋白信号后被激活，从细胞核转运到细胞膜上与之相互作用，进而削弱细胞核内的 PvSPL6 转录因子活性。PvSPL6 膜定位在调控柳枝稷茎节发育以及开花时间方面可能存在新的分子机制。.通过本研究确定了PvSPL6/8调控柳枝稷开花时间的生物学功能，解析了PvSPL6/8调控柳枝稷开花时间的调控机制，确定了PvSPL6亚家族核膜定位的关键响应因子，并且对其可能具有的生物学功能及其调控新机制进行了初步探索。最终挖掘到了与开花调控相关的候选因子PvMADS5、PvMADS32以及PvSOK2，为柳枝稷生物量遗传改良及分子设计提供了更多的新靶点。通过本项目的支持，研究结果目前已发表 SCI文章 1 篇（生物学大类 1 区），获得国家发明专利1项，在申专利 3 项，其中国际专利 1 项。同时，对其中的候选因子进行了转基因验证，获得了2-3份高生物量的柳枝稷种质新资源，为生物能源草以及牧草应用和推广储备了新的种