末端倒置重复序列中E盒缺失对番鸭小鹅瘟病毒毒力的影响

Muscovy duck-origin goose parvovirus (MDGPV), a novel genotype of goose parvovirus, caused acute intestine inflammation characterised by the fibrous and embolism of the small intestine. The relationship between the nucleotide sequence of Inverted Terminal Repeat (ITR) and the viral virulence has not been fully established. Research on other viruses show that the transcription-factor-binding-site motif (E-box) in the transcription star regions of the viral genes play an important regulatory role in replication and transcription of the viral genomes. Based on these findings, we will construct an infectious DNA clone of MDGPV and introduce different deletions into E-box in the nucleotide sequence of ITR and the recombinant mutants will be generated by the reverse genetics operation. We will locate the functional sequence motif (E-box) correlatd with viral growth dynamics, genetic stability and pathogenesis by determining and comparing these rescued viruses and investigate the effect of those deletions on MDGPV virulence. The present study will provide the important theoretical guidance for the prevention and control of MDGPV infection in China.

番鸭小鹅瘟病毒（Muscovy duck-origin goose parvovirus，MDGPV）是新基因型鹅细小病毒，主要引起雏番鸭严重肠道炎症，目前关于该病毒末端倒置重复序列与病毒毒力关系的研究还未见报道，基于病毒基因组转录起始区内转录因子识别基序（E盒）与病毒复制和转录调控密切相关，本研究利用反向遗传操作技术对MDGPV 末端倒置重复序列中E盒进行缺失并构建MDGPV突变体，对缺失突变前后的感染性克隆进行病毒拯救，通过测定获救病毒的增殖特性、遗传稳定性以及致病性，探讨末端倒置重复序列中E盒的缺失对MDGPV毒力的影响，为有效防控我国番鸭小鹅瘟提供重要的理论指导。

为研究E盒缺失对病毒复制和免疫调控的影响。在MDGPV强毒PT株全长感染性克隆pMDGPVPT的基础上，通过融合PCR方法对5’-ITR高变区进行人为缺失，通过In-Fusion拼接将MDGPV全基因组克隆于pBluescriptⅡ(SK+)载体中，构建了数个5’-ITR部分E盒缺失突变的MDGPV全长DNA克隆（p-PT-△E125，p-PT-△E258，p-PT-△E315，p-PT-△E125△E258，p-PT-△E125△E258△E315）。缺失突变体经卵黄囊接种转染11日龄番鸭胚后用间接免疫荧光检测病毒的拯救效果。结果显示，只有p-PT-△E315感染性克隆能拯救出感染性病毒r-PT△E315。生物学特性实验表明，r-PT△E315与r-PT均能感染番鸭胚后能够引起特征性病变，与其亲本病毒株PT相比，r-PT△E315的毒价及其在雏番鸭体内的增殖能力有所下降，在MDEF细胞上的复制能力增强。. 用ELISA法检测感染1日龄雏番鸭血清中IL-1、IL-6、IL-10与IFN-γ的动态变化。结果表明，与对照雏番鸭相比，r-PT△E315与r-PT感染雏番鸭后，细胞免疫相关的细胞因子的表达出现了不同程度的上调。r-PT△E315组雏番鸭血清中IL-1、IL-6 、IL-10与 IFN-γ的含量低于r-PT组。. 本研究基于实验室构建的MDGPV全长感染性克隆，构建了一系列E盒基序缺失突变体，最终成功获救了5’-ITR中第315位E盒基序缺失突变的病毒r-PT△E315。病毒学分析表明，MDGPV基因中第315位E盒基序缺失不会影响子代病毒的产生还能提高MDGPV感染番鸭胚成纤维细胞的能力。本研究为进一步研究E盒基序的缺失与MDGPV毒力之间的关系奠定了基础。.