慢性砷暴露的血清差异表达蛋白研究

Rat model of high arseic exposure will firstly be established in this study. Then proteomic technologies, including two-dimensional differential gel electrophoresis (2-D DIGE) and mass spectrometry (MS) will be used to screen and identify the differential expressed proteins in serum of high arsenic exposure rats. Simultaneously, epidemiological field survey will be conducted in the arsenicosis areas of China. Information of individuals like demographic characters, the history of arsenic exposure, and health information will be collected. Samples like water, blood, and urine will also be collected. A database with at least 100 subjected exposed to different level of water arsenic will be set up. Methods for protein analysis such as ELISA will be used to detect the protein contents in both rat serum and human serum for validation. At last, suitable statistical analysis methods will be used to assess the relation of every differential expressed protein to the level of arsenic exposure, to access the ability of every protein and the protein combination distinguishing the high arsenic exposure group and control group, to make sure the threshold value, sensitivity, and specificity of each differential expressed protein. Relative sensitive and specific serum protein biomarker are wished to be found by above study, thus to be used for the screening of early health problem of arsenic exposure.

本研究首先通过建立慢性砷暴露大鼠的实验动物模型，然后利用蛋白质组学技术手段- - 双向差异凝胶电泳（2-D DIGE）结合质谱（MS）技术，筛选慢性砷暴露大鼠血清差异表达蛋白。同时，在我国砷中毒病区进行现场流行病学调查，搜集调查对象的人口学特征、饮水砷暴露情况、健康情况等信息，采集水样以及血液、尿样等生物样本，建立至少100人的不同水平砷暴露人群数据库。进一步采用ELISA法等对鉴定出的慢性砷暴露大鼠血清差异表达蛋白进行大鼠血清水平和人群血清水平的双重验证。最后采用适宜的统计学分析方法评价每一个差异表达蛋白与砷暴露水平之间的相关性，评价每一个差异表达蛋白以及多个蛋白的联合用于区分高砷暴露与非暴露的能力，确定每一个差异表达蛋白区分高砷暴露与非暴露的最佳阈值以及灵敏度和特异度。期望通过以上研究寻找到慢性砷暴露致健康损害的相对敏感、特异的血清蛋白标志物，用于慢性砷暴露致人群健康损害的早期筛查。

目的：砷是一种多系统的毒物，然而砷的毒性作用机制尚未完全阐明。近年来，砷的内脏损伤效应逐渐受到国内外学者的广泛关注。本研究旨在筛选并验证亚慢性砷暴露大鼠的血清差异表达蛋白，为研究砷暴露致人群健康损害的血清蛋白标志物提供线索。.方法：将60只Wistar大鼠随机分为对照组和低、中、高剂量砷组，各组饮水中NaAsO2浓度分别为0、2、10、50mg/L。饲养12周。利用iTRAQ蛋白质组学技术筛选对照组与50mg/L组之间血清差异表达蛋白。采用ELISA、免疫组化、RT-PCR和Western blot等方法对筛选出的差异表达蛋白进行4组间的验证。.结果：①利用iTRAQ技术一共鉴定出201个蛋白，有12个蛋白的表达存在显著差异，其中上调的有2个，分别是载脂蛋白A-II（Apo A-II）、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)；下调的有10个，分别是结合珠蛋白(HP)、L-乳酸脱氢酶(LDH)、Fermt3、前纤维蛋白-1(Profilin-1)、14-3-3 ζ/δ、脂联素、微管蛋白、Rap 1A、蛋白LOC100361457、蛋白LOC100912012。②采用ELISA法共验证了9个蛋白在各组大鼠血清中的表达水平。其中，14-3-3 ζ、脂联素、HP、LDH和Fermt3等5种蛋白含量在4组间存在显著差异，与对照组比较，50mg/L组大鼠上述的含量显著下降（p<0.05），与iTRAQ实验结果相一致，而低、中剂量砷组变化不明显。Apo A-II、ASL、Profilin-1、Rap 1A等 4种蛋白的含量在4组间无显著变化。③免疫组化法检测对照组和低、中、高剂量砷组大鼠大脑皮质颗粒细胞14-3-3 ζ阳性率分别为59±4%、49±2%、41±2%和34±3%，各组之间存在显著差异（p<0.05）；与对照组比较，RT-PCR、Western blot法检50mg/L组大鼠大脑皮质14-3-3ζ表达含量显著降低（p<0.05），而低、中剂量砷组大鼠下降不明显。.结论:结合上述蛋白的生物学功能及与疾病的关系，初步认为14-3-3 ζ、脂联素、HP和Fermt3等4种蛋白可能在砷暴露引起神的神经损伤、糖脂代谢异常、肝脏损伤和血液疾病中发挥一定的作用，值得进一步研究。