阴离子交换蛋白AE2在移植肝胆管损伤中的作用与机制研究

Hydrophobic bile salts (HBS) play an important role in the pathogenesis of ischemia-type biliary lesions (ITBL) after liver transplantation. However, the exact action pathways for bile salts and its molecular mechanism remain unclear. Recent study shows that HCO3- secreted by cholangiocytes is essential for protection of biliary epithelial cells from HBS toxicity by inhibiting the protonation and subsequent intracellular permeation of HBS. Meanwhile, Anion exchanger type 2 (AE2) is the key molecule responsible for HCO3- secretion. Thus, Given the latest reports and our preliminary results, we tentatively propose that the downregulation and inactivation of AE2 were responsible for the HBS-mediated biliary epithelial damage through the decrease of HCO3- secretion and subsequent facilitation of the intracellular permeation of HBS. With the in vitro cultured human bile duct epithelial cells and mouse liver transplant model, we will first use the isotopic tracer technique to verify the role of AE2-mediated bile salt permeation and intracellular accumulation in the bile duct injury and peribiliary fibrosis,and then investigate the mechanism of downregulation and inactivation of AE2 after liver transplantation using gene silencing, luciferase gene reporter assay and other molecular biology techniques. This study will provide new theoretical basis for designing efficient prevention and treatment strategy of ITBL after liver transplantation.

疏水性胆盐(HBS)在移植肝缺血型胆管病的发生中起重要作用，但其作用途径及分子机制仍不清楚。最新研究显示，胆管细胞分泌的碳酸氢根离子(HCO3-)可抑制HBS质子化而阻止其细胞内渗透，对保护胆管细胞免受HBS损伤具有重要意义。而阴离子交换蛋白AE2是胆管细胞分泌HCO3-的关键分子。因此，结合前期实验结果，我们提出，肝移植后AE2表达及功能的减低可能通过降低HCO3-分泌，促进胆盐细胞内渗透，从而在HBS介导的移植肝胆管损伤中起重要作用。我们拟以体外培养的人胆管上皮细胞和小鼠肝移植模型为实验对象，首先利用同位素示踪技术证明AE2表达及功能降低对胆盐细胞内渗透积聚的作用，并分析其与胆管细胞损伤及胆管周围纤维化的关系；然后，我们利用基因沉默、荧光素酶报告基因分析等技术阐明肝移植后胆管细胞AE2表达及活性降低的分子机制。本项目将为移植肝缺血型胆管病变防治策略的设计提供新的理论依据。

疏水性胆盐(HBS)在移植肝缺血型胆管病的发生中起重要作用，但其作用途径及分子机制仍不清楚。结合既往研究证据及课题组前期研究成果，我们提出AE2表达及活性的降低可促进胆盐细胞内渗透，从而引起肝移植后胆管及其上皮细胞的损伤；而移植肝冷缺血/再灌注可能通过FXR—SHP—miR-506通路引起AE2表达的降低。我们首先以体外培养胆管上皮细胞为研究对象，利用缺氧小室建立细胞缺血/缺氧模型，研究发现在缺氧条件下，胆管细胞AE2蛋白的表达显著降低，且缺氧时间越长，降低越显著，且AE2蛋白的表达量与细胞内胆GDCA胆盐含量及细胞凋亡率呈显著负相关关系，而与促纤维化因子TGFβ1的分泌量也呈显著负相关关系。进一步研究发现，在缺氧条件下，胆管细胞FXR、SHP表达显著下降，而miR-506的表达显著上调。常氧培养条件下，抑制FXR表达可使SHP mRNA及蛋白表达水平显著下降，而使miR-506的表达水平显著上调，而miR-506 inhibitor和miR-506 mimics可分别促进和抑制AE2蛋白的表达，但对FXR和SHP的表达并无影响。常氧条件下，抑制SHP表达，可引起miR-506基因启动子转录活性显著增强；而在缺氧条件下，过表达SHP可显著抑制miR-506基因启动子转录活性，降低miR-506的表达。以C57BL/6J小鼠为供体及受体，建立重建肝动脉血供的小鼠肝移植模型，感染了AE2 shRNA 慢病毒载体的供肝胆管上皮细胞AE2表达显著降低，同位素示踪及液体闪烁计数检测结果显示，肝移植后14C-GCDC在感染了AE2 shRNA 慢病毒载体的供肝胆管胆汁中的恢复率显著降低，胆道过渡时间显著延长。相关性分析显示，AE2表达量与胆盐的胆道过渡时间、胆管损伤程度评分及胆管细胞凋亡指数均呈显著负相关关系。FXR缺失的供肝AE2表达显著降低，miR-506表达升高，移植肝胆管细胞内GCDC含量升高，胆管细胞损伤及胆管周围纤维化加重；而转染SHP 过表达载体或miR-506 shRNA慢病毒载体后，miR-506表达降低，AE2表达显著升高。本研究结果证明了AE2表达及功能降低可促进胆盐细胞内渗透积聚，引起肝移植后胆管及其上皮细胞损伤；初步阐明了FXR-SHP-miR-506信号通路可能是缺血/缺氧导致AE2表达抑制重要分子机制。