基于II类内含子的新一代基因组编辑系统

Genome editing technology with high efficiency and feasibility is generally required by synthetic biology and metabolic engineering. One of the key strategies and steps of genome editing is the introduction of DNA damage at specific sites, which triggers the DNA repair mechanism and results in targeted gene knock-out and knock-in. Mobile group II introns derived from bacterial microorganisms have been widely used in the genetic engineering of prokaryotes because they recognize and introduce DNA damage, and insert intron sequence at target sites specifically. However, the mobile group II intron not only leaves "scar" in the genome DNA but also requires free Mg2+ with high concentration, which does not meet the requirements of highly effective genome editing technology. The project will firstly employ the rational design and directed evolution to reconstruct the intron-encoded protein (IEP) and the intron RNA, the core elements of the mobile group II intron. The engineered IEP without reverse transcription activity but retains other functions and the engineered RNA with reduced requirement of Mg2+ will be obtained by high-throughput screening. On the basis of the engineered mobile group II intron, this study will finally establish a novel genome editing system with broad-host range and high efficiency. This group II intron-based system will be used as a new tool in the genetic engineering to understand cell functions.

高效、便捷的基因组编辑技术是合成生物学、代谢工程等领域的共性需求。在特定靶位点引入DNA损伤，引发DNA修复机制，从而实现基因的敲除、敲入是基因组编辑技术的关键策略及步骤之一。来源于细菌的II类内含子能够高效识别及切割DNA特定位点，已广泛应用于原核生物的遗传改造中，但其“有疤”及Mg2+依赖性不符合通用高效便捷的基因组编辑技术的要求。本项目通过理性设计及定向进化，对其核心的内含子编码蛋白IEP及内含子RNA元件进行改造，结合高通量筛选技术以期获得无逆转录活性但保留其余功能的IEP蛋白突变体以及缓解Mg2+依赖性的内含子RNA突变体，在此基础上构建新一代基于II类内含子的普适高效基因组编辑系统，克服传统Targetron系统存在的“有疤”及高浓度Mg2+依赖性的缺陷，为细胞功能的认识及改造提供新的技术工具。

高效、便捷的基因组编辑技术是合成生物学、代谢工程等领域的共性需求。来源于细菌的II型内含子能够高效识别及切割DNA特定位点，并能够通过自身的“归巢”机制插入到DNA靶位点，从而通过靶向插入实现基因失活。然而，该系统并不能实现任意的基因编辑。为了拓展II型内含子的应用范围，实现其基因编辑功能，进而开发新型的基因编辑工具，本项目首先借助蛋白质结构分析、能量计算和同源序列比较等生物信息学手段，分析了影响II型内含子反转录功能的关键氨基酸位点，并对此进行了体外突变，最终获得了15种完全失活反转录功能的突变体。上述突变体完全阻断了II型内含子的“归巢”功能，使之能够在靶位点引入DNA损伤。然后，为了方便分析和计算基因编辑的效率，本项目构建了不同的筛选与检测系统，并将筛选检测系统与Targetron系统联合构建了II型内含子基因编辑表征平台。最后，利用上述平台，以原核模式微生物大肠杆菌为例，检测了突变型II型内含子的功能，计算了其基因编辑效率，并分析了影响其基因编辑效率的因素。结果表明，我们成功构建了基于II型内含子的新型基因编辑体系，该体系具有在靶位点造成DNA损伤的功能，能够在靶位点随机插入或删除几个至数百个DNA碱基，且不具有基因编辑的碱基偏好性。通过对多个影响因素的优化，最终将其编辑效率提高到12.96%。总之，本项目构建的基于II型内含子的新型基因编辑系统，将为生命科学研究提供新的遗传改造工具。