新型嗜热基因组编辑系统的构建及研究

The genome editing is driving a new revolution in the field of life sciences. However, the existed genome editing systems are all constructed based on mesophilic microorganism and can not be applied in thermophilic microorganism, the existed genetic tools used in thermophilic microorganism don’t have the function of genome editing, this situation seriously restrict the development of thermophilic microorganism. Therefore, in order to solve the lack of the thermophilic genome editing tool in thermophilic microorganism, and to promote the research and application of thermophilic microorganisms, it is needed to develop a thermophilic genome editing system. This project intends to construct the thermophilic genome editing system from two different aspects. On the one hand, we chose the CRISPR-Cas9 system as the foundation to improve their thermostability through directed evolution of Cas9 nuclease and gRNA. On the other hand, we chose the Thermotargetron system, which was constructed previously and used to gene targeting in thermophilic microorganisms, to construct a new genome editing tools through inactivating the reverse transcriptase activity of intron edited protein (IEP). The mutation of IEP will block the retrohoming effect of group II introns, and leading to a double strands break, then the DNA damage will be repaired by host cell and finally to realize the genome editing. Based on the combination of this two aspects, we will finally construct a high efficiency thermophilic genome editing system, which will greatly promote the study and application of thermophiles.

基因组编辑技术推动了生命科学研究的重大变革，但现有基因组编辑系统均是基于中温微生物开发，不能在嗜热微生物中应用，而已有的嗜热遗传改造工具又不具备基因组编辑功能，这一现状严重制约了嗜热微生物的基因工程研究。本项目拟从两个方面入手，通过对现有遗传改造工具的优化升级，构建高效、特异的嗜热基因组编辑工具：一方面，以中温基因组编辑系统CRISPR-Cas9为基础，通过定向进化提高其核心元件Cas9核酸酶和gRNA的热稳定性，从而建立新型的嗜热CRISPR系统；另一方面，以前期建立的嗜热打靶工具Thermotargetron为基础，通过突变其内含子编码蛋白IEP反转录酶活性，使其失去“归巢”功能而产生双链DNA定点断裂，结合宿主DNA修复机制实现基因组编辑功能。基于上述双管齐下的研究策略，最终获得基因编辑效率高、热稳定好的嗜热基因组编辑系统，为嗜热微生物的遗传改造及功能研究提供新工具。

现有基因编辑工具都是嗜中温基因编辑工具，缺少嗜热基因编辑工具。本项目的目的是构建新型嗜热基因编辑工具，主要从以下两个角度开展研究：第一，以目前广泛应用的CRISPR-Cas9为基础，通过定向改造构建Thermo-CRISPR。第二，以具有基因打靶功能的嗜热II型内含子为基础，通过失活其反转录酶活性，阻断其在靶位点的归巢，引入DNA损伤，从而构建基于嗜热II型内含子的Thermo-InGE基因编辑系统。本项目在执行过程中，基于CRISPR-Cas9的嗜热基因编辑系统已有论文发表，因此本项目主要从嗜热II型内含子角度继续开展研究。首先，我们分析并筛选了影响嗜热II型内含子编码蛋白(IEP)反转录功能的关键氨基酸位点，构建了15个突变型IEP蛋白，并以此为基础构建了基于嗜热II型内含子的Thermo-InGE系统，然后，我们分析了Thermo-InGE系统在没有同源臂情况下的非同源末端链接功能以及在有同源臂情况下的同源重组功能。结果表明，在目前分析条件下， Thermo-InGE利用非同源末端连接机制和同源重组机制实现DNA损伤修复的效率都极低，且无论哪种情况下均存在细胞大量死亡的现象。分析其原因可能在于：第一，检测条件尚不适合，需要改进检测方法和分析条件。第二，内含子RNA或IEP蛋白的占位影响了非同末端链接和同源重组的功能。尽管Thermo-InGE在目前条件下仍不能进行基因编辑，但Thermo-InGE造成细胞大量死亡的现象，说明Thermo-InGE能够在靶位点引入DNA损伤，具有基因编辑的潜能，因此需要继续优化。此外，我们发现了嗜热II型内含子的一个新的碱基识别规律，即IBS2b/EBS2b位点的T/A碱基配对能够显著提高其基因打靶效率，基因打靶效率从野生型的24.5%提高到61.9%，为构建高效嗜热基因编辑工具提供了新的突破口。