半理性设计解除异丁香酚单加氧酶产物抑制的分子机制研究

With the increasing concerning to food safety, the production of food additives by biotechnology instead of chemical engineering has been gradually concerned. Vanillin is widely used in food, beverages, spices, medicine and other fields and the supply of natural vanillin is less than 1% of the market requirement. According to the European and USA rules, vanillin produced through a green biotechnological route can be labelled as natural as vanillin extracted from plants. Isoeugenol is one of the ideal precursors for the synthesis of vanillin and isoeugenol monooxygenase is the unique key enzyme of microbial transformation of isoeugenol into vanillin. The bottleneck for the current microbialtransformation of isoeugenol into vanillin is the inhibition of vanillin to the isoeugenol monooxygenase. This study focuses on the isoeugenol monooxygenase. For the first time, the semi-rational design of isoeugenol monooxygenase to remove its product inhibition is going to be conducted with the latest protein engineering technology—deep mutational scanning which based on the microfluidic and high-throughput sequencing technology. And the mechanism and regulation of the product inhibition will be dissected from the molecular level through structure simulation. Substrate and product inhibition is the ubiquitous problem in industrial biocatalysis and biotransformation process. This study results can provide a new solution to the product inhibition for other industrial enzymes.

随着各国对食品卫生与安全的重视，生物技术法替代化学法生产食品添加剂的研究逐步受到关注。香草醛广泛应用于食品和医药等领域，但天然香草醛的供应量不足市场需求的1%。根据美国和欧盟的规定，生物香草醛与植物提取的香草醛天然等同。异丁香酚是合成香草醛的理想前体，异丁香酚单加氧酶是微生物转化异丁香酚生成香草醛的唯一关键酶。酶法转化异丁香酚的技术路线中尚未解决的瓶颈问题是异丁香酚单加氧酶活性易受产物抑制。本研究以异丁香酚单加氧酶为研究对象，首次采取最新的蛋白质工程技术——基于微流体和高通量基因测序技术的深度突变扫描方法来解析与该酶产物抑制相关的关键位点，用以指导半理性设计改造，解除该酶的产物抑制问题；进而通过结构模拟从分子结构水平来解释和调控相关产物抑制解除的分子机制。产物和底物抑制是生物催化和生物转化工业实践中普遍存在的问题，本工作有望为解决其他工业酶类似的产物抑制问题提供新的理论和技术策略上的借鉴。

香草醛广泛应用于食品、饮料、香料、医药等领域，但天然香草醛的供应量不足市场需求的1%。根据美国和欧盟的规定，生物香草醛与植物提取的香草醛天然等同。异丁香酚是合成香草醛的理想前体，异丁香酚单加氧酶是微生物转化异丁香酚生成香草醛的唯一关键酶。本研究通过半理性设计即同源建模结合非理性设计即定向进化对异丁香酚单加氧酶进行蛋白质工程改造，有效提高了异丁香酚单加氧酶活性，其中采用新开发的“三标准”计算机系统选择5个氨基酸突变位点（即120,121,281,298和470）进行饱和突变筛选，获得了若干个活性提高的突变株，其中F281Q酶活性最高，为野生型菌株IEM的2.2倍，L470S，M298K，T121P转化能力也有明显提高，约是原始的2倍。成功构建突变体模型，并进行底物-酶分子对接和MD模拟分析，发现281位点原本侧链中带有苯环的苯丙氨酸被取代为谷氨酰胺后，底物通道的体积从12 Å3增加到16 Å3，研究表明该突变有利于底物从结合口进入和产物释放，从而解除了部分产物抑制。进一步通过构建异丁香酚单加氧酶自动诱导表达体系，并在此基础上建立了异丁香酚单加氧酶高通量筛选体系，经epPCR构建基因突变文库，筛选得到突变菌株F10，其异丁香酚单加氧酶活性提高至154%。同时，利用两亲性自组装功能的短肽（SAPs）18A和ELK16诱导融合蛋白异丁香酚单加氧酶18A/ELK16表达，生成活性酶聚集体快速简易地分离制备异丁香酚单加氧酶，通过对酶的动力学研究可知：IEM-Mxe-ELK16的Vmax、Km和Kcat分别是原始IEM的11.3、11.7和7.2倍，说明改造后的IEM-Mxe-ELK16酶与底物异丁香酚结合效率降低，缓解了底物抑制作用使得最大反应速率提高。另外应用壳聚糖膜吸附产物香草醛，考察其对转化异丁香酚生成香草醛工艺条件的影响，在最佳的转化条件下（pH 8.5，30 ℃，180 rpm，约0.5 g湿细胞，0.1 g壳聚糖膜）反应40 h后香草醛浓度可达4.1 g / L，同时构建突变体菌株IEM720-F281Q在该转化条件下转化30 h ，香草醛浓度达到4.50 g/L。本课题研究为酶催化法转化异丁香酚生产香草醛的工业应用奠定基础，为解决其他工业酶类似问题提供新的理论和技术策略上的借鉴。