香青兰总黄酮调控mTOR信号通路抑制细胞自噬的心肌保护效应机制研究

Myocardial ischemia reperfusion injury（MIRI）is a common cause of sudden death in clinical patients with heart diseases . As a new way of programmed cell death, autophagy participates in the development of MIRI, it is paid more attention to in MIRI. mTOR signaling pathway which is an important regulator of cell autophagy plays a role of “the guard” in the process of cell autophagy induced by MIRI. Dracocephalum Moldavica total flavones (TFDM) is a kind of natural flavonoids obtained from the characteristic advantage resources Dracocephalum Moldavica in Xinjiang and it had a clear effect on against myocardial ischemia and its mechanism against MIRI might be closely related to regulating mTOR signal transduction pathway according to our before research. Based on preliminary findings the new methods and technologies of modern pharmacological research will be used by establishing the models of neonate rats’ myocardial and rats’ myocardial ischemia reperfusion injury, and the influence on the development of MIRI with TFDM will start from the mTOR signaling pathway. New targets and mechanism of TFDM against MIRI from the level of overall, cells, protein and molecular will be clarified to establish a theoretical basis for further exploitation and utilization of this traditional Uighur genuine medicine. The results of the research will have certain guiding significance to promote and facilitate the study of Dracocephalum Moldavica modernization.

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是临床心脏病患者猝死的常见原因。自噬作为新的程序性细胞死亡方式，参与MIRI的发生发展，在MIRI中的作用成为研究热点之一。mTOR信号通路是细胞自噬的重要调节者，在MIRI诱导的细胞自噬过程中发挥“门卫”作用。香青兰总黄酮是从新疆特色资源香青兰中提取得到的一类天然黄酮类活性成分。前期研究显示，香青兰总黄酮具有确切的抗心肌缺血作用，其机制可能与调控mTOR自噬信号转导通路密切相关。因此，本研究将采用现代药理学研究的新方法和新技术，以mTOR信号通路为切入点，通过心肌细胞缺氧/复氧损伤及大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨香青兰总黄酮对mTOR自噬信号通路的调空作用和对MIRI发生发展的影响，为香青兰总黄酮抗MIRI提供理论和实践依据。研究结果对促进维药香青兰现代化研究和推动维药作用机理研究具有一定的指导意义。

采用结扎心脏左冠状动脉前降支进行缺血30min后，剪断结扎线恢复血液流通进行再灌注2 h构建I/R模型，采用H9C2细胞缺氧2h后复氧4 h，建立心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型。应用香青兰总黄酮（TFDM）、自噬抑制剂Chloroquine、自噬激活剂Rapamycin、TFDM+Rapamycin组、TFDM+Compound C组、TFDM+LY294002组等药物分组进行干预。监测大鼠Ⅱ导联心电图评价模型；TTC法测定心肌梗死面积；试剂盒检测心肌酶的变化及心肌细胞 caspase-3和细胞色素 C（CytC）活性，免疫组化检测心肌细胞 Bax、Bcl-2 活性；Western Blot检测 Becin1、Atg5、LC3、PI3K、Akt、mTOR 等蛋白表达及磷酸化水平。体外细胞方面，采用 MTT 法检测心肌细胞的增值率，HE染色观察心肌细胞的形态；TUNEL 法检测心肌细胞凋亡，Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白及PI3K、Akt、mTOR 的蛋白表达及磷酸化水平；RT-PCR 测定自噬相关蛋白 Beclin-1、LC3-II 在 mRNA水平。结果，TFDM预处理后，缺血（I）大鼠及缺血再灌注（I/R）大鼠心肌梗死面积显著减少；显降低缺血再灌注大鼠血清中LDH、CK-MB、AST的活性，提高SOD活性；caspase-3活性及Cytochrome c表达下调，心肌细胞凋亡率显著降低，I/R大鼠心肌组织LC3 mRNA表达下调，mTOR mRNA表达上调；下调了LC3、Beclin1表达，上调了Bcl2表达；免疫组织化学结果显示LC3小部分在细胞核表达，大部分在细胞质中表达，TFDM与丹参滴丸通过抑制心肌中自噬相关蛋白表达降低自噬水平。细胞实验表明，改善了I/R大鼠心肌病理学形态；显著提高了H/R后H9C2细胞的活力；升高了p-mTOR、p-AMPK、p-AKT蛋白表达；PI3K/Akt信号通路中Akt、GSK-3β的磷酸化水平显著增加；LY294002药物联用组明显增加了Bax的表达，减少了Akt、GSK-3β磷酸化水平及Bcl-2的表达。研究阐明了TFMD 调控mTOR信号通路抑制细胞自噬心肌保护的靶向机制，为香青兰在临床心肌缺血的治疗及其进一步深入开发提供科学依据，为进一步发掘利用这一传统的维吾尔道地药材奠定基础。