大麦多分蘖基因hnt1的功能分析和代谢途径研究

Exploitation of elite barley cultivars with high yield is regarded as an efficient strategy for barley breeding. Tillering has a considerable role in the formation of yield in cereal crops. In our previous study, the hnt1 mutant deprived from Vlamingh was used to investigate the tillering ability. Based on the combined strategy of map-based cloning and comparative genomics methods, the hnt1 gene has been identified. Moreover, the hnt1 mutant is resistant to exogenous application of GR24, indicating that the hnt1 is probably involved in strigolactones signaling. In order to unravel the specific the mechanism of tillering, the molecular biological, metabonomic and proteomics methods will be applied to analyze the hnt1 mutant. The main contents are as follows: ⑴ The Transcription Profiles of the hnt1 gene; ⑵ The subcellular localization of the hnt1 gene; ⑶ To verify whether the mutation of the hnt1 gene is responsible for the phenotype of the hnt1 mutant, several transformed plants will be obtained through Agrobacterium-mediated transformation; ⑷ The proteomic difference of the hnt1 mutant will be identified by using iTRAQ technique; ⑸ The content of plant hormones will be identified in the hnt1 mutant by using HPLC-MS technique.

选育优质高产大麦新品种是我国大麦育种的主要方向。分蘖是麦类作物生长发育的基本特征，在产量形成中具有重要作用。在前期工作中，我们从大麦突变体库中筛选了一株多分蘖突变体hnt1，并克隆了hnt1基因。通过外源植物激素处理突变体，我们发现hnt1基因与独脚金萌发素内酯调控途径相关。为了阐明hnt1基因调控大麦分蘖的分子机制，本项目拟采用组学技术，从转录组学、蛋白组学，代谢组学等不同角度系统分析突变体hnt1，主要内容包括：⑴ 利用转录谱分析技术，研究hnt1基因在不同发育时期、不同组织器官中的表达情况。⑵采用GFP融合蛋白技术示踪hnt1蛋白在细胞内的分布。⑶ 利用转基因技术验证hnt1基因的功能。⑷ 利用同位素标记相对和绝对定量技术进行蛋白质组学分析，并对植物激素相关蛋白进行蛋白免疫印迹分析。⑸ 采用高效液相色谱-质谱联用技术，分析突变体hnt1不同发育时期的植物激素含量变化。

分蘖是大麦生长发育过程中形成的一种特殊的分枝特性，决定了大麦成穗率的高低。本项目筛选到一个大麦多分蘖突变体High number of tillers 1（hnt1），突变体表现出分蘖数显著增多、植株高度明显降低、窄叶等表型特征。组织解剖学观察表明，突变体分蘖数量的增加是促进分蘖芽外伸生长的结果。通过研究我们发现hnt1基因编码产生一个半胱氧酸蛋白酶，转基因互补验证显示该基因负向调控大麦分蘖数量。基因表达分析显示该基因在分蘖期的茎基部中表达量最高，并且该基因在叶片和茎的维管束系统以及叶腋处（分蘖发生处）特异性表达。我们通过双向电泳分析发现突变体中PPIase蛋白积累，BiFC和Co-IP分析显示hnt1和PPIase互作，原位PCR结果显示hnt1和PPIase在茎基部表达区域相似。烟草体内消化实验分析显示hnt1能够介导PPIase的降解，PPIase调控生长素通路中的AUX/IAA蛋白。通过测定分析了突变体及野生型中PPIase基因和IAA基因家族的表达量，并结合生长素处理等试验，我们认为hnt1蛋白通过PPIase影响生长素通路从而调控大麦分蘖。本项目研究成果刷新植物分枝调控理论，为大麦优质高产育种实践提供支持。