调控自噬对抑制蛋白酶体活性所致胶质瘤细胞死亡的影响

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，具有高复发率、高病残率和高死亡率的特点。蛋白酶体已经成为抗胶质瘤治疗的新靶点。我们研究证实，抑制蛋白酶体活性不仅能诱导胶质瘤细胞凋亡，还能激活脑胶质瘤细胞内的自噬，抑制自噬则能增强脑胶质瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。其他学者的研究还表明，过度的自噬还能导致肿瘤细胞死亡。因此，我们提出通过调控自噬（抑制自噬或者过度激活自噬）来增强蛋白酶体抑制剂对胶质瘤杀伤作用的学术假说。在本课题中，我们拟采用体外培养胶质瘤细胞结合裸鼠接种胶质瘤模型，应用电镜、免疫组化和蛋白印迹分析等方法对抑制自噬诱导胶质瘤细胞凋亡的机制以及过度激活自噬诱导胶质瘤细胞死亡这两个问题展开研究，这将有助于进一步揭示自噬对胶质瘤存活的意义，同时探讨治疗胶质瘤的新策略。

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，具有高复发率和高死亡率的特点。我们以往研究证实，抑制蛋白酶体活性不仅能诱导胶质瘤细胞凋亡，还能激活脑胶质瘤细胞内的自噬，抑制自噬则能增强脑胶质瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。在本课题中，我们采用体外培养胶质瘤细胞结合裸鼠接种胶质瘤模型，应用免疫组化、荧光显微镜和蛋白印迹分析等方法探讨了蛋白酶体抑制剂对脑胶质瘤的治疗作用及自噬对其影响。我们发现：1、蛋白酶体抑制剂通过氧化应激反应诱导胶质瘤细胞的凋亡。随着蛋白酶体作用时间的延长，胶质瘤细胞内活性氧的含量显著性增高，线粒体膜电位显著下降，同时胶质瘤细胞的死亡率也显著增加。应用抗氧化剂Tiron后，胶质瘤细胞内的活性氧显著减少的同时，细胞死亡率也显著下降。进一步研究显示，抗氧化剂Tiron能够显著地抑制蛋白酶体抑制剂诱导的胶质瘤细胞凋亡，这与Tiron能够抑制蛋白酶体抑制剂MG-132诱导的促凋亡蛋白Bax，Caspase-3及PARP的剪切有密切关系。体内研究显示，蛋白酶体抑制剂不仅能够显著抑制接种到裸鼠皮下的胶质瘤细胞的生长，还能诱导其促凋亡蛋白的表达，并降低抑制凋亡蛋白的表达。2、抑制自噬促进胶质瘤细胞凋亡与增强内质网应激反应有关。我们采用自噬抑制剂3MA预处理胶质瘤细胞后，再加入蛋白酶体抑制剂后，发现与自噬相关的蛋白如LC3II和Beclin表达下降的同时、与内质网应激相关的促凋亡蛋白CHOP，Caspase12均显著高表达。同时，流式细胞术检测显示，细胞凋亡显著增加。3、为了进一步证实内质网应激在蛋白酶体抑制诱导胶质瘤细胞死亡中的作用，我们采用内质网应激诱导剂Tunicamycin预处理胶质瘤细胞后，然后再加入蛋白酶体抑制剂。我们发现Tunicamycin使胶质瘤细胞的内质网应激增强的同时，也增加了蛋白酶体抑制剂诱导得胶质瘤细胞的凋亡。Tunicamycin预处理使得胶质瘤细胞中与内质网相关的促凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的表达均显著提高。4、我们还对天然蛋白酶体抑制剂Shikonin的抗胶质瘤的效果和机制进行了探讨。我们发现，Shikonin不能诱导胶质瘤细胞的自噬，但是能够诱导胶质瘤细胞的程序性坏死。以上研究表明，蛋白酶体抑制剂诱导胶质瘤细胞的凋亡与氧化应激反应及内质网应激反应有密切关系。抑制自噬能够增强蛋白酶体抑制剂诱导的依赖内质网应激反应的胶质瘤细胞凋亡，增强内质网