EvpP在迟缓（杀鱼）爱德华氏菌与大菱鲆巨噬细胞互作关系中的角色研究

Edwardsiellosis, caused by Edwardsiella tarda, has been reported worldwide in economically important fish species. This infection also leads to serious economic losses in the aquaculture becoming an important factor restricting the development of aquaculture industry. Unclear intracellular parasitic mechanism are the main reason for difficult prevention and controlling of edwardsiellosis. Macrophages play a very important role in the inflammatory response of fish infected with E.tarda. The interaction between E. tarda and macrophage is involved in pathogenic process. EvpP is secretory protein of T6SS and its importance have been found in E. tarda and host cell interactions, but its role is not clear. The research is to construct the EvpP mutant strain and complementary strain. On the basis of establishing the best infection conditions, in vitro and in vivo experimental infection will be conducted using the wild-type, mutant and complementation trains in order to answer the following problems:(1) Whether there exists a certain correlation between EvpP and E. tarda proliferation in macrophage (2）whether EvpP have influence on apoptosis and immune regulation function of macrophages. In an attempt to approach the roles of the EvpP and reveal the molecular mechanism of the interaction between E. tarda and macrophages, we will screen and identify interaction proteins of macrophages with EvpP using a yeast two-hybrid system. The research aims to give comprehensive evaluation to EvpP and provide more experimental basis for its important participation in the interactionbetween E. tarda and macrophage.

Edwardsiella tarda的胞内寄生机制不清楚是鱼类爱德华氏菌病难以防治的主要原因之一。鱼类主要通过巨噬细胞参与对E. tarda的炎症应答，二者的相互作用是E. tarda致病过程的重要环节。已发现T6SS的分泌蛋白EvpP在E. tarda与宿主细胞的互作过程中发挥重要作用，但其具体扮演角色尚不明确。研究拟构建E. tarda 的EvpP突变株和互补株，以感染模型为基础进行大菱鲆巨噬细胞体内外侵染实验明确如下问题：(1) EvpP是否与E. tarda在巨噬细胞内增殖具有相关性；（2）EvpP是否会通过影响巨噬细胞凋亡及免疫调节功能达到其致病目的。为深入揭示这种互作关系的分子机制，通过筛选巨噬细胞的互作蛋白进一步明晰EvpP的角色定位。研究旨在综合评价EvpP的功能，为证实其参与E. tarda 与巨噬细胞的互作过程并在其中承担重要的角色提供更多依据。

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是淡海水养殖鱼类的一种极其重要的致病原。鱼类主要通过巨噬细胞参与对E. tarda的炎症应答，而E. tarda是胞内寄生菌能够在巨噬细胞内生存和增殖以达到其逃避免疫系统攻击的目的。E. tarda与巨噬细胞的相互作用是迟缓爱德华氏菌病发生过程中的重要环节并决定了疾病的最终走向和结局。已发现T6SS的分泌蛋白EvpP在E. tarda与宿主细胞的互作过程中发挥重要作用，但其具体扮演的角色尚不明确。本研究成功构建了E. tarda 的evpP缺失株、互补株以及E. tarda 侵染巨噬细胞的模型。在此基础上分析了EvpP与E. tarda胞内生存和增殖的相关性，胞内存活实验结果显示evpP的缺失能够明显削弱E. tarda在巨噬细胞内的增殖能力，提示EvpP有助于促进E. tarda在巨噬细胞内的增殖；到底EvpP是如何影响E. tarda的胞内命运的？通过开展EvpP对巨噬细胞产生NO和凋亡的影响研究以期探讨EvpP可能的作用机制。通过Greiss法测定比较菌株侵染后不同时间点巨噬细胞的NO水平发现，与野生株（WT）相比， ∆evpP诱发了更多的NO分泌量（P＜0.05），可以推断EvpP在抑制巨噬细胞NO产生方面有一定作用，E. tarda能够通过抑制宿主产生NO来逃避巨噬细胞的抑制和杀伤作用。采用Annexin V/PI双染法流式细胞术和Caspase-3蛋白表达检测探究EvpP对巨噬细胞凋亡的影响，发现∆evpP能够显著增加巨噬细胞的凋亡率（P＜0.05）。研究结果提示：EvpP参与了E. tarda对巨噬细胞的抗凋亡作用，能够通过抑制巨噬细胞的凋亡达到其长期胞内生存和繁殖的目的。为深入揭示这种互作关系的分子机制，在构建E.tarda侵染巨噬细胞cDNA文库的基础上，采用酵母双杂交技术筛选出EvpP的胞内互作蛋白RPS5并进行了免疫共沉淀验证。Rps5已被证实能够参与细胞的凋亡和信号转导等过程，可以推测EvpP很可能通过与Rps5的相互作用发挥其生物学效应包括抑制巨噬细胞凋亡和NO产生。本研究证实了EvpP参与E. tarda 与巨噬细胞的互作过程并在其中承担了比较重要的角色，为E. tarda致病机理和胞内寄生机制的研究提供了新的思路，对鱼类迟缓爱德华氏菌病的防治具有十分重要的意义。