清肺通络方抑制MP诱导肺上皮细胞及血管内皮细胞Caspase-3/8、Fas/FasL表达的机制研究

Mycoplasma (MP) has become a common pathogen among childhood pneumonia, and the difficulty of clinical treatment because of its easy to develop into severe cases with multi-system complications and extensive antibiotics resistance in recent years. Our group proved qingfeitongluo decoction has significant curative effect in treating childhood Mycoplasma pneumonia. Through experiments in vivo and in vitro, this project intends to focus on gene and protein expressed by Caspase - 3/8 and Fas/FasL in lung epithelial cells and endothelial cells, to explore the apoptosis mechanism of alveolar epithelial cells and of human lung microvascular endothelial cells induced by mycoplasma, with the inhibitory target genes of qingfeitongluo decoction on cell apoptosis by gene chip and siRNA interference technique and with measurement of related inflammatory factor levels at the same time, to further interpret the mechanism on how qingfeitongluo decoction inhibit apoptosis in alveolar epithelial cells and pulmonary microvascular endothelial cells induced by mycoplasma, and provide a scientific basis for treating childhood mycoplasma pneumonia with qingfeitongluo decoction.

肺炎支原体（MP）已成为引起儿童肺炎的常见病原体，因其易产生重症、多系统并发症及抗生素广泛耐药，成为临床治疗的难点。本项目组临床试验研究证明清肺通络方治疗支原体肺炎疗效显著，本项目拟通过体内外实验，针对肺上皮细胞以及血管内皮细胞内Caspase-3/8、Fas/FasL基因与蛋白水平的表达，探索支原体诱导肺泡上皮细胞以及人肺微血管内皮细胞凋亡的机理，并以基因芯片及siRNA干扰基因技术，寻找清肺通络方抑制细胞凋亡的靶基因；同时结合相关炎症因子水平测定，进一步阐释清肺通络方抑制支原体诱发肺泡上皮细胞以及人肺微血管内皮细胞凋亡的机制，为清肺通络方治疗儿童支原体肺炎提供科学依据。

本研究体内体外实验研究相结合，从肺上皮细胞及血管内皮细胞 Caspase-3/8、Fas/FasL 基因、蛋白表达以及清肺通络方通过抑制肺炎支原体感染诱导肺上皮细胞及血管内皮细胞 Caspase-3/8、Fas/FasL高表达的疗效机制为切入点，深入验证支原体感染导致宿主细胞凋亡作用以及清肺通络方的临床疗效机制与作用靶点。体外实验部分通过流式细胞术观察肺炎支原体刺激肺泡上皮细胞、人肺微血管内皮细胞的凋亡情况，以及清肺通络方的干预对细胞凋亡的影响。并以基因芯片技术寻找 Caspase-3/8、Fas/FasL 通路相关靶基因，结合 RNA 干扰技术研究清肺通络方的干预对肺炎支原体诱导的肺泡上皮细胞及人肺微血管内皮细胞凋亡的影响。发现清肺通络方通过抑制 Caspase-3/8、Fas/ FasL 通路相关靶基因的表达从而抑制细胞凋亡。体内实验通过观察肺炎支原体感染对炎症因子 TNF-a、TGF-β、IL-1β、 IL-8 水平以及清肺通络方对炎症水平的影响，发现清肺通络方对肺炎支原体感染小鼠血清中的炎症因子水平起到了下调作用。结合运用 RT-PCR 法、Western Blot 法对肺炎支原体感染小鼠及清肺通络方干预小鼠的肺泡灌洗液及肺组织中 Caspase-3/8、Fas/FasL 通路及相关因子进行测定，验证了支原体感染对模型小鼠细胞凋亡作用，以及清肺通络方通过抑制 Caspase-3/8、 Fas/FasL 通路中相关靶基因的表达抑制细胞凋亡。本研究通过体外结合体内两部分实验内容， 验证肺炎支原体对炎症因子 TNF-a、TGF-β、IL-1β、IL-8 的上调作用，以及清肺通络方对炎症的抑制作用。本研究深入探索了肺炎支原体通过 Caspase-3/8、Fas/FasL 通路诱导肺泡上皮细胞及人肺微血管内皮细胞凋亡的机制，以及清肺通络方通过抑制 Caspase-3/8、Fas/FasL 通路相关靶基因（Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Apaf-1、PARP、PKC、Cytochrome C）的表达而抑制肺炎支原体诱导肺泡上皮细胞及人肺微血管内皮细胞凋亡的机制。证实了清肺通络方在支原体肺炎中的临床治疗作用。