放疗介导的线粒体损伤激活cGAS-cGAMP-STING-NF-κB信号通路并诱导脐静脉内皮细胞持续分泌TGF-β1的机制研究

Radiation pulmonary fibrosis (RPF) severely affects the health of patients. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) plays a crucial role in pulmonary fibrosis, and TGF-β1 increases after radiotherapy, but the mechanism remains unclear. Previous experiments showed that umbilical vein endothelial cells continued to secrete TGF-β1 after ionizing radiation, NF-κB transcription activity increased, mitochondrial membrane potential decreased, and mtDNA overflowed mitochondrial outer membrane. This subject speculates that radiotherapy regulates the continuous secretion of TGF-β1 by umbilical vein endothelial cells through mitochondrial-nuclear reverse signaling. This study intends to use the umbilical vein endothelial cell line EA.Hy926, HUVEC and rat model of radiation-induced pulmonary fibrosis after radiation and/or mPTP inhibitor cyclosporin A treatment, transmission electron microscopy will be used to observe mitochondrial structure, ROS and ATP will be detected to understand mitochondrial function, mitochondrial membrane potential and mPTP openness will be detected to explore mitochondrial membrane stability. Confocal microscopy will be used to observe whether mtDNA spilled into the cytoplasm, and whether the spilled mtDNA promoted TGF-β1 expression through cGAS-cGAMP-STING-NF-κB pathway will be detected. Our research aims to provide potential intervention targets for exploring anti-fibrotic treatments and reducing late-stage response to radiotherapy.

放射性肺纤维化（RPF）严重影响患者健康和生命。转化生长因子β1（TGF-β1）在肺纤维化中起着重要作用，放疗后TGF-β1增多，但机制尚不清楚。前期实验发现，电离辐射后的脐静脉内皮细胞持续分泌TGF-β1，NF-κB转录活性增高，线粒体膜电位降低，mtDNA溢出线粒体外膜。综合文献推测：放疗通过线粒体-核逆向信号调控脐静脉内皮细胞持续分泌TGF-β1。本课题拟采用脐静脉内皮细胞系EA.Hy926，HUVEC及放射性肺纤维化大鼠模型，在X线照射和/或mPTP抑制剂cyclosporin A处理后，使用透射电镜观察线粒体结构，检测ROS及ATP了解线粒体功能，检测线粒体膜电势及通透转换孔mPTP开放程度了解线粒体膜稳定性，共聚焦显微镜观察mtDNA是否外溢到细胞浆，外溢的mtDNA是否通过cGAS-cGAMP-STING-NF-κB促进TGF-β1表达，为探索抗纤维化治疗提供潜在干预靶点。

放疗引起的晚期纤维化是常见的临床问题，TGF-β1在纤维化的发生中起着关键性作用，但射线照射后TGF-β1增加的原因尚无定论。本课题通过射线照射人脐静脉内皮细胞EA.Hy926构建持续分泌TGF-β1的模型细胞（EA.Hy926-R细胞），发现EA.Hy926-R细胞线粒体的功能遭到破坏（表现为线粒体复合体Ⅰ活性和亚基含量、线粒体膜电位水平及ROS均下降；mtDNA外溢至细胞质、线粒体融合增加、自噬激活，线粒体内膜断裂、嵴结构紊乱甚至几乎完全消失）。进一步研究发现，EA.Hy926-R细胞中发生线粒体功能障碍，使TDP-43聚集在线粒体内，促使线粒体DNA外溢，与DNA传感器cGAS结合，激活下游干扰素刺激基因STING-转录因子NFκB-TGFβ1信号通路。亲本细胞中加入CCCP后线粒体膜电位下降（p<0.05），线粒体DNA外溢至细胞质，cGAS-STING-NFκB信号通路被激活（p<0.05）;抑制cGAS-STING-NFκB信号通路后，TGF-β1的含量均下降（p<0.05）；EA.Hy926-R细胞中线粒体及胞质内TDP-43含量均升高（p<0.05）；抑制TDP-43的表达后，线粒体DNA外溢减少，cGAS-STING-NFκB通路及TGF-β1的含量下降（p<0.05）；然而在过表达STING（p=0.0268）的细胞株中抑制TDP-43的表达后，TGF-β1的含量无明显变化（p＞0.05）。阿司匹林和卡托普利分别通过抑制cGAS和NFκB因子，阻遏TGF-β1的持续分泌，为放射性晚期纤维化防治提供了精准的分子通路和干预靶点。本课题依托武汉大学中南医院临床数据库及病理数据库进行组织蜡块收集，通过免疫组化的方法比较X射线照射后放射野内组织的STING、NFκB、TGF-β1分子含量变化，手术前进行新辅助放疗的患者，较未进行照射的患者，照射野内组织的STING、NFκB、TGF-β1分子含量增加（p<0.05），与细胞实验相符；患者外周血TGF-β1含量在放疗期间呈现先升高再下降最终缓慢升高的特点，而服用卡托普利的患者可以缓解TGF-β1含量增高的情况，与细胞实验药物干预结果相符，为临床进一步干预正常组织放射反应提供了理论及临床基础。