贾第虫病毒非编码RNA克隆及功能分析

贾第虫是一种重要的人兽共患原虫,同时又是"生物活化石"。迄今对贾第虫细胞及生物学特性缺乏详尽了解,而贾第虫病毒的发现为研究贾第虫的细胞及生物学特性奠定了基础。目前已报道贾第虫内存在非编码RNA,贾第虫病毒内是否存在非编码RNA及其功能如何尚未见报道。本研究针对目前贾第虫病毒非编码RNA在调节自身感染复制过程中的作用及其对宿主基因表达与调控机制尚不清楚等问题，以犬贾第虫为研究对象，对贾第虫病毒基因组生物信息学分析，病毒非编码RNA的克隆、验证及功能分析等研究，以期搞清贾第虫病毒非编码RNA对自身和宿主的基因表达与调控分子机制，从而为其它动物病毒与其宿主间的相互作用研究提供参考，具有重要的理论意义和学术价值。

贾第虫是一个原始的真核生物，同时也是一个重要的人兽共患病病原，具有重要的进化生物学研究价值，贾第虫作为模式生物仍然有很多问题需要解决。贾第虫病毒是由一个线形的末端开放的7.0 Kb dsRNA和100 KDa的衣壳蛋白组成。小分子RNA包括siRNA，microRNA，PiRNA。其中microRNA是由内含子或编码基因间隔区的 RNA基因编码的，大小约20-24个碱基的单链小分子RNA，能通过与靶 mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。对于贾第虫病毒是否存在小分子非编码RNA并不清楚。本研究通过生物信息学分析及Solexa高通量测序，结合VMIR软件预测，初步确定10条贾第虫病毒候选非编码小RNA，利用RT-PCR、Northern杂交、Dicer酶切割、荧光定量PCR等方法验证贾第虫病毒非编码小 RNA为贾第虫病毒的microRNA，命名为 GLV microRNA1，其大小为32nt，位于pol蛋白编码区。这是目前所发现的第一条原虫病毒的microRNA，长度也是在所发现的microRNA中最长的。通过knock-down GLV MicroRNA1，荧光定量PCR检测发现抑制GLV microRNA1后，贾第虫病毒拷贝数增长30%左右，表明GLV microRNA1能有效控制贾第虫病毒的拷贝数，但对贾第虫无论从形态、生长曲线等方面尚未发现有明显的影响。双荧光素酶报告试验测定表明GLV microRNA1的靶标gag-pol 的3'UTR发挥重要作用。最有意思的是，这是目前唯一一条位于一个基因的编码区域的microRNA。该发现可能进一步拓宽了人们对非编码RNA的生成方式认知，即mRNA可能需要在编码非编码RNA和翻译蛋白质之间有一个平衡，这种平衡可能是基因表达调控的一种新方式。