中国特有小型猪中内源性反转录病毒的变异特征及其机制研究

中国特有小型猪有可能发展为异种移植的优良供体。猪内源性反转录病毒（PERV）是猪-人异种移植、猪源制品与生物活性材料中最受关注的病原体，目前其病原性危害尚不明确。本项目是基于五指山猪近交系繁育多代后PERV发生较多G→A突变的研究基础，通过从多代次小型猪基因组中克隆PERV前病毒并测序及比对序列，以探寻随小型猪繁殖代次增加，其中PERV的变异特征。同时，我们推测可能是天然免疫抗病毒分子猪APOBEC3F（pA3F）的作用造成G→A突变并对PERV的复制与增殖造成深远影响，因此通过构建pA3F高表达与低表达的PK15细胞模型，鉴定pA3F对PK15细胞中释放的PERV发生的作用并深入探索其效应。本研究的意义是：探明小型猪中PERV的变异特征及可能的机制，将有助于进行异种移植中的病毒安全性评价及培育PERV阴性表达的小型猪，对于我国特有小型猪的开发利用具有重要意义。

本研究通过从多代次小型猪基因组中克隆PERV前病毒并测序及比对序列，旨在探寻随小型猪繁殖代次增加，其中PERV的变异特征。同时，根据前期研究结果推测可能是天然免疫分子猪APOBEC3F（pA3F）的作用造成G→A突变并对PERV的增殖造成影响，因此通过构建pA3F高表达与低表达的PK15细胞模型，鉴定pA3F对PK15细胞中释放的PERV发生的作用并研究其可能机制。本研究将有助于进行异种移植中的病毒安全性评价及培育PERV阴性表达的小型猪。.主要研究结果包括以下几个方面：.（1）五指山小型猪PERV变异特征研究.扩增近交系连续五代次的五指山小型猪PERV-env基因全长并测序，运用生物信息学方法将其与参考序列进行多重序列比对和遗传进化分析。结果显示，本实验获得的PERV-env核苷酸序列中有较多碱基突变，G→A突变数目相对其他碱基明显较多，且存在偏好位点。.（2）pA3F对PERV的抑制作用研究.在PK-15细胞中利用pA3F过表达及RNA干扰等手段，对PERV-pol mRNA及PERV反转录酶变化进行检测。结果显示，在pA3F过表达的PK-15细胞中PERV-pol mRNA与PERV反转录酶水平与对照相比显著降低（p<0.05），且变化与pA3F的表达量之间具有剂量依赖关系；在pA3F下调细胞中PERV-pol mRNA与PERV反转录酶水平与对照组比较显著提高（p<0.05），其中以沉默pA3F的740-764bp的序列最有效，PERV-pol mRNA增长4.172±0.251倍，反转录酶达到88.58±1.46pg/孔。实验结果表明pA3F对PERV的复制具有抑制作用；.（3）pA3F抑制PERV复制的可能机制研究.收集转染pCDNA3-Flag-pA3F重组质粒的PK15细胞培养上清液，通过超离获得PERV粒子并采用RT-PCR鉴定，再通过Western blot证实pA3F被包装入PERV病毒粒子中。分析稳定表达pA3F的PK15细胞的PERV基因组序列发现，PERV在pA3F持续表达条件下发生了G→A突变，以上结果提示pA3F很可能由PERV-Gag引导被包装入病毒粒子，最终通过胞苷脱氨作用对PERV产生抑制。.通过本课题研究，培养研究生3名，发表SCI论文1篇，国内核心期刊论文4篇，正在整理的英文论文1篇。做特邀/大会报告2次。