纳米银及活性氧对线粒体 DNA 聚合酶γ复制功能影响的研究

Silver nanoparticles has been widely used in the field of food preservation because of the broad-spectrum antimicrobial activity. The reactive oxygen species (ROS) generated by different sizes of silver nanoparticles will induce oxidative DNA damage in mitochondria. The mitochondrial DNA polymerase γ is also as a target of oxidative damage. So it is necessary to study the genotoxicity of silver nanoparticles in mitochondria. The effect of silver nanoparticles and ROS on the replication of DNA polymerase γ will be studied by molecular biology techniques.On the one hand, we will explore the composition of the mitochondrial dNTP and the oxidation of DNA polymerase γ which affected by silver nanoparticles with different sizes. The DNA polymerase activity,elongation rate and DNA binding efficiency will be investigated in this study. On the other hand, the replicaiton fidelity of DNA polymerase γ and the mutation rates caused by silver nanoparticles and ROS will be determined by DNA amplification in vitro.Antioxidants will be targeted used to protect the dNTP and enzymes and decrease the mutation rates of mitochondrial DNA. In addition,the interactions of silver nanoparticles with enzymes and DNA molecule will be investigated by the atomic force microscopy(AFM).The biological effects of silver nanoparticles on the DNA polymeraseγin mitochondria DNA replication will be studied from the subcellular and molecular level.

纳米银因其广谱、高效的抑菌性而被广泛应用于食品储藏与保鲜领域。由于不同粒径的纳米银生成的活性氧对线粒体DNA分子具有氧化损伤作用，而且线粒体DNA聚合酶γ是活性氧作用的靶蛋白，所以有必要从线粒体遗传毒性的角度研究纳米银的生物学效应。本申请拟采用分子生物学的方法研究纳米银及活性氧对线粒体DNA聚合酶γ功能的影响，一方面研究不同粒径的纳米银影响线粒体dNTP 的组成和DNA 聚合酶γ的氧化损伤，主要考察DNA聚合酶活性、延伸能力和双链DNA分子的结合效率等方面；另一方面通过建立体外基因扩增实验研究DNA 聚合酶γ的复制保真度和产物DNA分子的突变频率；同时采用抗氧化物质有针对性地保护线粒体内dNTP 和蛋白质，提高DNA聚合酶γ复制的保真度。此外，利用原子力显微镜考察纳米银对酶和DNA 的相互作用的影响。通过纳米银对线粒体DNA聚合酶γ复制功能的影响，从亚细胞和分子水平研究纳米银的生物学效应。

本项目以小鼠淋巴瘤细胞为研究对象，分离纯化线粒体，采用超高效液相色谱测定dNTP 及其前体物质含量；利用活性氧检测试剂盒检测线粒体活性氧的水平；利用蛋白氧化损伤试剂盒检测纳米银对线粒体蛋白质的氧化损伤。 . 同时本项目研究了纳米银对于线粒体DNA 聚合酶γ的影响。经过构建质粒表达载体，进行线粒体DNA 聚合酶γ的表达和纯化，诱导表达DNA聚合酶γ并进行纯化。体外条件下，不同粒径的纳米银对DNA聚合酶γ的氧化损伤分析；测定纳米银对DNA 聚合酶γ与DNA分子链结合的影响；利用原子力显微镜分析纳米银与聚合酶、DNA分子的相互作用。目前为止发表期刊论文共计9篇，其中包括SCI检索期刊论文3篇，EI检索论文1篇，核心期刊论文5篇，申报发明专利1项。. 研究纳米银及活性氧对于线粒体DNA聚合酶性质的影响对于研究纳米材料的靶分子选择性，深入认识纳米材料的生物安全性具有重要意义。本项目针对纳米材料的特性，寻找特定目标细胞器和靶蛋白的探索能够为纳米安全性分析技术提供一个新的视角，同时与线粒体遗传相关的分子生物学研究可以为抗氧化功能性食品的开发提供理论基础。