长链非编码RNA lnc-LASER通过HNF-1α-PCSK9 调控肝脏胆固醇平衡的机制研究

Previous genome-wide association studies reported about 100 single nucleotide polymorphism (SNP) loci associated with blood lipids. To our surprise, many of these variants (43%) lie in intergenic regions and hence remain largely unexplained. Most of the nearby genes were not annotated in classical lipid metabolism pathways, indicating that the loci in non coding gene region may regulate lipid metabolism in an indirect pathway. In our preliminary experiments, we screened and indentified an novel long non-coding RNA encoded in lipid related SNP(rs486394) region. Lnc-LASER knock down by small interfering RNA(siRNA) in HepG2 cells decreased the intracellular total cholesterol levels and two critical genes(HNF-1α and PCSK9) involving in cholesterol metabolism. We measured lnc-LASER expression in nuclear and cytosolic fractions and found that lnc-LASER was mainly localized in the nucleus. We employed bioinformatics analysis to validate the possible high binding affinity of lnc-LASER with the EZH2 protein in polycomb complex 2. We performed RNA immunoprecipitation(RIP) experiment and confirmed a physical interaction occurs between lnc-LASER with the EZH2 protein. Based on the above mentioned preliminary experiment results, we hypothesis that lnc-LASER binds to EZH2 and regulate the histone methylation status of HNF-1α promotor region. Lnc-LASER binding regulate HNF-1α expression and involved in cholesterol metabolism in a PCSK9 dependent pathway. In the present study, we try to reveal the molecular mechanism of lnc-LASER in regulating HNF-1α and PCSK9 by RIP and CHIP methods in HepG2 cells and gold hamster. Our results may suggest that increased lnc-LASER expression may play an important role in liver cholesterol metabolism.

GWAS报道近百个血脂水平相关的SNP位点，然而43%的位点位于基因非编码区域，提示这些位点可能间接影响脂代谢。预实验发现rs486394编码长链非编码RNA-LASER。HepG2细胞敲低lnc-LASER 表达后，细胞内胆固醇降低，伴有与脂代谢密切相关基因的下调（HNF-1α、PCSK9）。核质分离发现lnc-LASER分布于细胞核，生物信息学预测lnc-LASER与多梳蛋白复合体2中EZH2蛋白有较高的亲和力并由RNA免疫沉淀实验证实。基于这些结果，我们提出lnc-LASER可能通过结合EZH2蛋白，从而调控HNF-1α启动子组蛋白甲基化，导致HNF-1α表达的改变，并通过下游PCSK9基因而调控胆固醇代谢。本研究拟以HepG2细胞、金黄地鼠为研究对象，利用RNA免疫沉淀、CHIP等技术，研究lnc-LASER调控HNF-1α及PCSK9的分子机制，明确其在肝脏胆固醇代谢中的作用。

全基因组关联分析研究发现许多基因的多态性同血脂水平相关，但是这些多态性如何影响血脂目前尚待进一步研究证实。既往的研究发现长链非编码RNA同多种生理及病理过程相关，与疾病相关的热点多态性区域编码多种长链非编码RNA而参与疾病的分子生物学调控。我们提出研究猜想，在血脂相关的热点区域可以编码长链非编码RNA而参与血脂代谢的调控。在本研究中，我们通过生物信息学工具分析了目前报道的血脂相关的热点多态性区域，从中筛选并鉴定出一个新的长链非编码RNA（AP000770.1-1）并将其重命名为LASER。LASER在肝脏及外周单核细胞中均有比较高的表达，人群研究中我们发现LASER的水平同血浆中胆固醇的含量呈正相关。我们还发现在未使用他汀的患者中，LASER的表达同血浆PCSK9的含量也呈正相关。通过siRNA的方法敲降LASER的表达后可以降低肝脏细胞内胆固醇的含量，同时表达谱芯片证实LASER表达改变后影响了部分胆固醇代谢相关基因的表达，我们通过qt-PCR的方法验证了芯片的结果，发现敲降LASER后可以降低HNF-1α、PCSK9的表达。既往研究表明HNF-1α可以转录调控PCSK9的表达，而如果给予HNF-1α的阻断剂黄连素干预后，敲降LASER对PCSK9的降低效应随着消失，提示LASER可能通过HNF-1α途径调控PCSK9的表达。随后，我们通过RNA荧光原位杂交、核质分离等方法证实LASER主要在细胞核内表达，生物信息学分析提示LASER同组蛋白修饰酶复合体REST/coREST的LSD1蛋白亚基具有较高的结合可能性。随后我们通过免疫共沉淀等方法证实LASER可以同LSD1结合，而给予LSD1的抑制剂环苯丙胺后，LASER对PCSK9的调控作用随着消失。我们利用染色质免疫共沉淀技术证实敲降LASER的表达后，HNF-1α的启动子区域激活组蛋白标记H3K4me降低。随后的实验中，我们证实他汀在降低胆固醇的同时可以升高LASER的表达，继而引起PCSK9的升高，提示存在着反馈性调控的作用而减弱了他汀的疗效，我们发现这种效应是核转录因子LXR介导的。如果在使用他汀的同时联合抑制LASER的表达，可以发挥协同降胆固醇的效应，针对以LASER为代表的非编码RNA可能成为新一代的降脂治疗的靶点。