基于DNA甲基化研究慢性乙肝证候差异表观遗传机制

Chronic hepatitis B is a major disease which serious harm to human health. Our previous study of miRNA mechanisms for chronic hepatitis difference syndrome have many achievements, but also face a problem difficult to explain, that is why different syndromes have same microRNA? Deeply literature review found ideas, miRNA and DNA methylation mutual regulating, then, affecting gene expression. According this, we speculate, the reason of the same miRNA appear different syndromes may be due to the DNA methylation, which is one of the main mechanisms of epigenetic. And the literature confirmed, abnormal DNA methylation plays an important role in the develop process of chronic hepatitis B. Therefore, we hypothesized that, different DNA methylation level may be one of the main epigenetic mechanisms of different syndrome of chronic hepatitis B. We will base on DNA methylation, using "DNA methylation -miRNA- target gene "as the main line to conduct a study. We will use Genome-wide DNA methylation chip, RT-PCR, Western Blot and other methods to detect the DNA methyltransferase, DNA methylation profiles, DNA binding protein, HBV chronic infection methylation-associated protein, and miR-122 target gene cyclin G1. This study will first reveal the biological basis of the difference syndrome of chronic hepatitis B from the perspective of epigenetic DNA methylation.

慢性乙肝是严重危害人类健康的重大疾病，课题组前期在慢性乙肝证候差异miRNA机制研究取得成果的同时，面临不同证候存在相同miRNA难以解释的问题。查阅文献发现，miRNA与DNA甲基化之间存在相互调控，进而影响基因表达。据此我们推测，相同miRNA出现不同证型的原因可能在DNA甲基化的表观遗传调控上。且文献资料证实，DNA甲基化异常确实在慢性乙肝病程中起着重要作用。故我们提出DNA甲基化水平差异可能是慢性乙肝证候差异的主要表观遗传机制之一的假说，从DNA甲基化切入，以“DNA甲基化—miRNA—靶基因” 为主线，采用全基因组DNA甲基化芯片、RT-PCR、Western Blot等法对DNA甲基化转移酶、DNA甲基化谱、DNA结合蛋白、HBV慢性感染甲基化相关蛋白、miR-122靶基因cyclin G1等进行检测，首次（未见报道）从DNA甲基化表观遗传角度揭示慢性乙肝证候差异的生物学基础。

慢性乙肝是严重危害人类健康的重大疾病，其发展过程与DNA甲基化对基因的表达调控密切相关。本研究在课题组前期基础上，从DNA甲基化切入，以“DNA甲基化—miRNA—靶基因”为研究主线，采集脾胃湿热证和肝郁脾虚证慢性乙型肝炎患者的样本，采用Illumina 850k甲基化芯片等法对DNA甲基化转移酶、DNA甲基化谱、DNA结合蛋白、HBV慢性感染甲基化相关蛋白、miR-122靶基因cyclin G1等进行检测，观察各组间DNA甲基化差异表达的情况，对差异表达的DNA甲基化位点涉及基因进行GO富集和KEGG分析，并通过TargetScan、miRDB、Cytoscape等对两证候部分相同miRNAs靶基因进行预测，构建DNA甲基化基因与miRNAs预测靶基因共表达网络图。研究结果显示，CHB脾胃湿热证组与肝郁脾虚证组间显著差异甲基化位点420个，其中高甲基化位点237个，低甲基化位点183个，差异位点的基因共介导了437条GO条目，其中82条具有显著差异。CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证间最显著的高甲基化位点为cg10765459位于基因COL6A2，最显著的低甲基化位点为cg07445365位于基因STK32C，差异DNA甲基化位点的GO富集主要涉及肌动蛋白相关细胞及组织，KEGG pathway主要涉及ErbB信号通路及代谢通路等。CHB脾胃湿热证的形成可能与LILRA3和CHTF18等差异基因的甲基化有关，与T细胞共刺激诱导的肝脏炎症相关；CHB肝郁脾虚证的形成可能与BMPR1B和 LCE3C等差异基因的甲基化有关，与树突棘的改变及物质代谢相关。进一步对两证型相同的miRNAs进行DNA甲基化水平关联分析，对miRNAs预测靶基因与DNA甲基化涉及基因建立共表达网络图，即“miRNA-靶基因-DNA甲基化”共表达网络图，发现相同miRNAs在两不同证候中均存在各自独有的共表达基因，相同的miRNAs重复出现在不同证候中的原因可能是由于其影响不同靶基因的甲基化，且甲基化水平具有差异性而引起。本研究从DNA甲基化表观遗传角度部分揭示了慢性乙肝证候差异的生物学基础，说明DNA甲基化差异是慢性乙肝证候差异的生物学基础之一，相同miRNA出现不同证型的原因与DNA甲基化的表观遗传调控有关。本课题共资助发表相关期刊论文3篇，其中SCI论文1篇，培养博士研究生2名。