纳米孔结合分子信标应用于miRNA的无标记检测

MicroRNAs are a class of short non-coding RNAs (about 18-22 nucelotides) that are crucial in cell differentiation, cell cycle regulation and cell apoptosis and signalling pathways. It was found that aberrant expression of microRNAs existed in all types of tumors and microRNAs can be released from tumor into bloodstream in a stable form. Therefore, microRNA is a useful biomarker for monnitoring, staging and early diagnosis of cancer. There are several different strategies reported in literature for the detection of microRNAs, including isothermal amplification, colorimetry, fluorescence, electrochemical analysis, bioluminescence, molecular beacon and all kinds of new detection methods involving nanomaterials. In this application, we propose to use nanopore sensors for the detection of microRNAs. We design the new DNA probes by introducing molecular beacon structure in order to improve the selectivity. Furthermore, we intend to use alpha-hemolysin mutants to enhance the detection sensitivity, and thus further lower the detection limit of the assay. If implemented successfully, this proposal should establish a highly sensitive and selective label-free method for the detection of microRNAs. We plan to use the newly developed method in the detection of clinically relevant samples.

微RNA（microRNA）是一类含有18至22个核苷酸的非编码RNA，对细胞的分化、调控细胞循环、细胞凋亡以及细胞信号传导通路均有着极其重要的作用。由于微RNA在肿瘤中的异常表达，且由肿瘤释放到血液中的微RNA能够稳定存在，因此检测跟肿瘤相关的血液中循环的微RNA成为癌症早期监测，分期和诊断的一条重要途径。目前文献中检测微RNA的方法有很多种，包括qRT-PCR法，等温扩增法，比色法，荧光法，电化学方法，生物发光法，分子信标法和基于纳米颗粒的各种微RNA检测方法。本项目提出利用纳米孔的方法来进行微RNA的免标记检测研究，并将分子信标的结构引入到探针设计中，进一步提高微RNA检测的特异性。而溶血素突变体的应用则有望提高检测灵敏度，从而进一步降低检测限。本项目的成功实施将建立一种高灵敏度、高特异性、免标记的微RNA检测新方法，我们拟将新建立的方法运用到实际临床样本的检测中。

微RNA（microRNA）是一类含有18至22个核苷酸的非编码RNA，对细胞的分化、细胞循环、细胞凋亡以及细胞信号传导通路均有着极其重要的作用。由于微RNA在肿瘤中的异常表达，且肿瘤释放到血液中的微RNA能够稳定存在，因此检测血液循环中跟肿瘤相关的微RNA成为癌症早期监测，分期和诊断的一条重要途径。在本项目中，我们采用纳米孔技术来进行微RNA的免标记检测研究。我们设计了一种基于三链分子信标的DNA探针，其中茎环结构DNA与另一段经过二茂铁-瓜环修饰的DNA片段形成了三链DNA结构。其环状部分DNA的序列与微RNA的序列互补，当微RNA分子与三链DNA作用时，与环状部分DNA形成双链结构，从而打开三链DNA结构，释放出中间二茂铁-瓜环修饰的DNA片段，该片段穿过alpha-溶血素纳米孔时，能够产生非常特征的电流信号。通过对这个信号的统计分析，我们即可以计算出目标微RNA分子的浓度。我们发现三链DNA探针对只含一个碱基突变的同族microRNA具有很好的选择性，并开展了对于肺癌标志物let-7家族的7a-7g的特异性检测。另外，结合DNA编码分子技术，我们还针对let-7a-c开展了同时检测研究，结果表明在混合样本中三链DNA探针对目标microRNA的选择性和灵敏度均不受干扰，可对混合体系中的microRNA进行同时定量分析。结合纳米孔小型化阵列研究，我们发展的方法有望在microRNA的临床检测中发挥重要的作用。