CTCF在I型单纯疱疹病毒裂解感染中作用机制研究

The zinc finger DNA binding factor CTCF is the key chromatin regulator implicated in essential nuclear processes including chromatin insulation, imprinting, long-range regulatory interactions. Herpes Simplex Virus type I (HSV-1) is a DNA virus that enters productive infection in epithelial cells with rapid transcription and DNA replication. As lytic HSV-1 infection activates host DNA damage response, which could silence viral transcription, very little is known about how the virus evades this effect. We found that CTCF is recruited to HSV-1 replication center and interacts extensively with the HSV-1 genome. The recruitment requires the zinc finger region of CTCF and is facilitated by the ATM kinase pathway. Interestingly, a key histone mark of host DNA damage response, γH2A.X, is also recruited towards the HSV-1 replication centers, and forms a cage like structure around the HSV-1 replication foci. Knock down of CTCF disrupts these foci, leading to diffused staining of ICP4 in most infected cells, and the cage like structure of γH2A.X disappears, and γH2A.X enters the viral foci. Consistent with this observation, knock down of CTCF results in repression of viral gene transcription, reduced viral genome copy number and viral yield. These data suggest that CTCF play a key role organizing the viral replication centers and preventing viral transcription from being silenced by host factors. In this application, we will test this hypothesis by a combination of subdiffraction microscopy, immunofluorescence and DNA FISH to visualize the interaction between DNA damage repair factors and the HSV-1 genome in the presence or absence of CTCF. In addition, we will examine directly at molecular level, using ChIP-qPCR and ChIP-seq, how knocking down or knocking out of CTCF affect the binding of DNA damage repair factors, RNA pol II and key chromatin marks to the viral genome. Our study will shed light on the host control of DNA virus transcription, replication, and viral host interaction at the higher chromatin architectural level.

绝缘子蛋白CTCF调控染色质高级结构。HSV-1感染细胞后迅速进入转录和复制，此过程会激活细胞DNA损伤修复应答系统并抑制病毒转录。对此HSV-1如何应对知之甚少。我们发现CTCF被招募到HSV-1复制区，并与病毒基因组有广泛的相互作用，同时DNA损伤修复标志蛋白γH2A.X聚集到病毒复制区形成笼状结构包裹住复制区。敲低CTCF后γH2A.X变得弥散，渗入到病毒复制区，并且病毒基因转录水平下降，基因拷贝数及产率减少。上述结果提示CTCF在组织病毒复制区高级结构、保护病毒转录不被宿主因子沉默中起关键作用。为验证此假说我们将利用超分辨显微技术结合免疫荧光和DNA FISH，观察敲低和敲除CTCF后DNA损伤修复因子与病毒复制区的结合，同时采用ChIP-qPCR和ChIP-seq方法在分子水平进行验证。本研究对DNA病毒转录和复制及其与宿主应急系统和染色质高级结构的相互作用具有重要意义。

绝缘子蛋白CTCF是重要的组织染色质高级结构和调控基因组转录的表观遗传因子，但其在DNA病毒中但功能还不清楚。HSV-1感染细胞后迅速进入转录和复制，此过程会 激活细胞DNA损伤修复应答系统并抑制病毒转录。我们发现 CTCF被招募到HSV-1复制区，并与病毒基因组有广泛的相互作用，提示 CTCF在组织病毒复制区高级结构、保护病毒转录不被宿主因子沉默中起关键作用。在此项目中我们利用细胞、分子生物学和表观遗传手段，包括ChIP-qPCR和ChIP-seq等对CTCF在HSV-1病毒转录和复制过程中的功能进行了深入研究。我们发现CTCF被病毒基因组招募并，并通过帮助延伸型RNA Pol II结合病毒基因组，阻止异染色质相关蛋白结合病毒基因组，从而起到帮助病毒裂解期基因表达（Lang et al. 2017a）。通过免疫荧光结合荧光显微镜和超分辨率荧光显微镜技术，我们阐释了HSV-1裂解感染过程中，组蛋白、转录相关蛋白、DNA损伤相关蛋白与病毒转录复制区的关系（Lang et al. 2015, Li et al. 2016）。.为了深入研究HSV-1的感染机制我们通过RNA-seq分析了更加全面的揭示HSV-1病毒感染宿主细胞后，宿主基因的表达变化（Hu et al. 2016）。从这些研究中，尤其是CTCF被DNA损伤修复信号招募到病毒复制区的结果给CTCF的功能提出了重要提示，即CTCF在基因组中的重要功能还包括维持基因组稳定性。我们对此进行了深入研究，发现CTCF直接参与双链DNA断裂修复：CTCF是通过ATM激酶和MRN复合体中的NBS招募到DNA损伤位点,并与同源重组修复蛋白Rad51相互结合，促进Rad51蛋白在修复位点的聚集促进DNA的修复（Lang et al., 2017b），这一发现在基因组高级结构的组织和基因组稳定性的维持建立了功能和机制上的联系。这一结果也阐明HSV复制过程中需要CTCF的另外一个重要原因，即促进病毒的复制过程中的DNA重组。.在项目资助的研究中，我们还成功建立了树鼩感染HSV-1的裂解期和潜伏期动物模型，为进一步更深入的研究HSV-1感染的分子机制提供了比小鼠更适合的动物模型（Li et al. 2016）。我们基本阐明了CTCF在HSV-1转录和复制过程中的作用机制， 验证了我们最初的科学假设，也为今后的研究打下了良好的基础。