Rfx6基因在胰岛发育和胰岛素翻译中的调控机制研究

Islet development and dysfunction is the basis of the incidence of diabetes. The RFX6 gene is a key gene for islet development. However, Rfx6 knockout mice cannot survive and it is difficult to further investigate their mechanism. Our previous study found a diabetic pedigree with RFX6 mutation. In particular, we successfully constructed a viable rfx6 knockout zebrafish model using Cas9 technology, which laid the foundation for further study on the role of RFX6 gene. The zebrafish model has a typical diabetic phenotype. The islet structure was looser compared with wide-type zebrafish. Further study showed that pancreatic α, δ, and PP cells disappeared, but β cells were present. Interestingly, there was no significant change in insulin mRNA level, while the protein level was significantly lower. This project intends to use a variety of fluorescent fish in cross with gene knockout zebrafish. We will use in situ hybridization, real-time PCR and Western to detect the rfx6 mechanism of islet cell development and differentiation. We will further overexpress and knockdown rfx6 gene to investigate insulin secretion and islet function of the model animals. The molecular mechanism of rfx6 gene and translation initiation factor were used to study the effects of insulin translation on diabetes mellitus through RNA-seq and CHIP-seq technology. This study is helpful to understand the mechanism of RFX6 gene on islet development and insulin translation and its relationship with diabetes.

胰岛发育与功能异常是糖尿病发病的基础。RFX6基因是胰岛发育的关键基因。但Rfx6基因敲除小鼠无法存活，难以深入研究其机制。课题组前期研究发现了一个RFX6基因突变的糖尿病家系，特别是应用Cas9技术成功构建了能存活的rfx6基因敲除斑马鱼模型，为深入研究RFX6基因的作用奠定了基础。该斑马鱼模型具有典型糖尿病表型，胰岛结构松散，α、δ和PP细胞均消失，但β细胞存在。有趣的是，其胰岛素mRNA水平无明显变化，而蛋白水平明显降低。本课题拟采用多种荧光鱼杂交基因敲除斑马鱼，通过原位杂交、荧光定量等方法研究rfx6调控胰岛细胞发育和分化的机制。分别过表达和敲减rfx6基因，检测模型动物的胰岛素分泌和胰岛功能，并用分子表达谱和染色质免疫共沉淀等技术研究rfx6基因是否与翻译起始因子结合从而影响胰岛素翻译导致糖尿病。本课题有助于深入了解RFX6基因对胰岛发育及胰岛素翻译的作用机制及其与糖尿病的关系。

课题组采用CRISPR/Cas9构建的rfx6突变斑马鱼中表现出明显的糖尿病表型。病理发现敲除斑马鱼的胰岛未能形成致密结构。RFX6在斑马鱼体内敲除后，对胰岛β细胞发育没有明显影响。而对胰岛α细胞、γ细胞和Ghrelin细胞均有重要影响，使这些基因的表达明显降低。Western和免疫荧光结果显示，同野生鱼相比，rfx6敲除鱼的胰岛素蛋白水平下降明显，而RNA-seq结果显示insulin的RNA水平无明显变化。ChIP-seq结果显示，rfx6可以与翻译起始位点eif2a和eif5的启动子和增强子区域结合，从而影响蛋白的翻译，最终导致糖尿病。本研究提供了胰腺发育过程中Rfx6的直接靶基因，并指出Rfx6是调节胰岛素蛋白翻译的潜在治疗靶标。. 课题组围绕KCNH6在人类和小鼠胰岛素分泌和葡萄糖稳态中的作用进行研究发现，KCNH6功能障碍，使细胞内钙水平增加，短期来看导致高胰岛素血症。但细胞内钙的慢性升高，导致β细胞的钙应激，过度胰岛素分泌及细胞凋亡，从长期来看导致低胰岛素血症。其作用机制可能是通过改善胰岛β细胞以及肝脏的内质网应激和凋亡从而改善血糖。.此外，课题组对MIN6细胞株进行了混合CRISPR传递和单细胞转录组分析。计算和生物学分析均表明，MIN6细胞系的功能可分为5个簇，包括内分泌细胞、基底细胞、上皮细胞和神经内分泌细胞。由于胰岛素转录的差异表达，第五簇与其他四个簇不同，被称为lnc-RNA富集簇。同时采用实验证实了lncRNA GM26917和Cenpw与胰岛素转录密切相关。课题组同时进行研究发现，高浓度的碳酸氢盐会增加胰腺β细胞中葡萄糖诱导的胰岛素分泌。临床病例研究发现，血清阴离子间隙(AG)与空腹血糖受损和糖尿病的风险有关。.项目负责人以第一作者／通讯作者发表SCI论文9篇，中文核心2篇，均有项目标注。课题组职称晋升2人，博士毕业3人。项目负责人参加国际会议两次。作为团队成员荣获2019年中华医学科技奖医学科学技术二等奖（排名5/10）和2020年华夏医学科技奖二等奖（排名5/15）。