大肠杆菌超氧化应激时赖氨酸乙酰化修饰网络的化学热动力学状态对中心碳代谢系统的调控作用

The purpose of this project is to explore the regulatory role of lysine acetylation modification in metabolic flux redistribution process under paraquat induced oxidative stress. In addition,the projct aims to reveal the underlying mechanism of different acetylation on the various substrates by the sole acetylation systems.The project holds a conjecture that oxidative stress would exert disturbance on both chemical dynamic and thermodynamic state of acetylation /deacetylatton system, thereby driving the coordinated changes in acetylation states of the various metabolic enzymes.The conjecture also assumed the changes in acetylation state contribute to metabolic flux redistribution in response to the oxidative stress. The pertubation of acetylation system as well as its dynamic and thermodynamic constants (Km,Kcat and possible Kd)were explored by means of metabolomics analysis, mRNA detection method and enzymatic method.Then,we utilize epitope tags fusion techniques, mass spectrometry and proteomic method to analyze the resulting effect on the acetylation spectra. Afterwards, we will use 13C metabolic flux to validate the actual role of acetylation in metabolic flux redistribution process. This project aims at understanding the regulatory mechanism of acetylation on metabolic flux and would be meaningful in renovation and design of particular metabolic network. Besides, this project help to understand the disruption of oxidative stress on the the acetylation process, providing a new perspective about the pathogenic mechanism of oxidative stress,thus would contribute to screening new targets and finding new treatments for oxidative stress-related diseases. This project has been of interest and significance to both the systems biology and medical communities.

本项目旨在探究超氧化应激情况下赖氨酸乙酰化修饰在代谢流量重分配过程中的调控作用，同时部分解释单一（去）乙酰化体系对众多不同底物的差异化调控机制。本项目假说认为超氧化应激会对（去）乙酰化体系的化学热动力学状态产生扰动,驱动代谢酶乙酰化修饰谱改变，最终对代谢流量重分配产生贡献。为此，我们利用代谢物组学手段,mRNA检查和酶学手段，解析超氧化应激对（去）乙酰化体系的化学动力学（酶活）和热力学扰动，测量（去）乙酰化体系的动力学和热力学参数，特别是（去）乙酰化酶的Km，Kcat和Kd；利用亲和标签融合和质谱技术分析乙酰化修饰谱改变的原因；利用13C代谢流量验证乙酰化修饰在代谢流量重分配过程中的调控作用。本项目有助于了解乙酰化对于中心代谢调控的机理,对于改造和设计具有特定流量的代谢网络有重要意义;本项目从新视角认识氧化应激的致病机理，为氧化应激相关疾病的诊疗提供新的思路，靶点和途径。

本报告内容分成三部分。（1）赖氨酸乙酰化修饰对大肠杆菌氧化应激影响。（2）超图框架内基于旋转张量向量积的基因组尺度代谢网络比对方法。（3）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对聚球藻生物脂质代谢的调控作用。.（1）我们对Red同源重组与I-SceI筛选相结合的无痕基因操作技术进行优化，使其可以使用较短的同源臂；并证实sacB导致突变率较高，sacB基因并不是一个好的负筛选指示基因。使用此方法，以BW25113为基础，我们构建△patZ和△cobB两种无痕敲除突变株和mdh，ppc，pck基因的尾部插入His-tag的突变株。在此基础上，我们研究了乙酰化修饰对大肠杆菌氧化应激响应的影响，过氧化氢在体外对苹果酸脱氢酶活性的影响，不同乙酰化状态下过氧化氢在体内对苹果酸脱氢酶活性的影响。由于一些不可抗因素（详见正文），没有完成后一部分内容，但这些成果为继续深入研究奠定了基础，具有积极意义。.（2）生物网络比对方法已经发展和演变成了一个基于图论的数十种方法共存的工具箱。然而，代谢反应比简单的成对相互作用更复杂，往往包含三个或更多参与组分。本文介绍超图（hypergraph）和关联超图分别描述代谢网络及其可能的比对。通过识别对称张量的最大Z-特征值来比对代谢网络。利用位移高阶幂方法来求得最优匹配结果。我们引入了一种计算策略，将超对称张量与矢量乘积平均加速250倍。该算法在基于spark的分布式计算集群上实现后，收敛速度进一步显著。我们通过大肠杆菌MG-1655和嗜盐古细菌DL31的全基因组代谢网络之间的比对来证明该框架的有效性。这是第一次在代谢物水平和酶水平同时对全基因组代谢网络进行比对。.（3）以Synechococcus sp. PCC 7002为基础，构建了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, ppc) 敲除株和过表达株。研究了敲除或过表达ppc基因对细胞生长、生物质积累，代谢浓度尤其是脂质代谢物浓度变化和含量变化的影响；并分析了其内在调控机制。本研究首次描述了ppc基因对蓝藻脂质代谢的影响。我们的结果表明敲除ppc可显著提高蓝藻脂质合成，改变其组成。因此ppc可以作为提高蓝藻生物柴油的潜在靶点。