飞蝗卵子发生的microRNA调控机制研究

The migratory locust, Locusta migratoria is a evolutionarily primitive insect species with the panoistic ovarioles. Juvenile hormone (JH) has been known to be the primary hormone to control vitellogenesis, oocyte maturation and ovarian development in the migratory locust, but the molecular mechanisms of locust oogenesis remains unclear. MicroRNA (miRNA) plays an important role in insect development, metamorphosis and reproduction, but research on miRNA in insect reproduction has been mostly limited to Drosophila melanogaster. The role of miRNA in juvenile hormone mediated oogenesis in locusts has not been explored. To unveil the potential role of miRNA in locust oogenesis, we initially performed RNAi for Ago1, a key regulator of miRNA biogenesis and function and found that depletion of Ago1 in female adult locusts dramatically decreased the expression of vitellogenin (Vg) and severely impaired the follicular epithelium development, terminal oocyte maturation and ovarian growth. We also observed that the selected conserved miRNAs respond to JH administration and the levels of some selected miRNAs appear to correlate with the change of endogenous hemolymph JH titers. Our preliminary data indicate that miRNAs play a crucial role in locust oogenesis. This research proposal is thus aimed to identify miRNAs involved in the regulation of locust oogenesis and their target genes, and to elucidate the mechanisms of miRNA regulation in locust oogenesis.

飞蝗是无滋式卵小管，它的卵子发生包括卵黄原蛋白生成、卵母细胞成熟与卵巢发育都由保幼激素（JH）调控，但不了解飞蝗这类昆虫卵子发生的分子调控机制。microRNA被认为是昆虫发育、变态与生殖的一个重要调控因子,但目前对microRNA调控昆虫生殖的研究并不多，报道主要集中于果蝇（滋养式卵小管），没有关于昆虫卵子发生中JH与microRNA之间调控关系的报道。我们的初步研究发现，Ago1 RNAi能够显著抑制飞蝗卵黄原蛋白生成、卵母细胞成熟和卵巢发育，一些microRNA能够响应JH，它们在飞蝗卵子发生期的转录水平与JH滴度呈相关趋势。这些初步结果表明，microRNA在飞蝗卵子发生中可能发挥非常重要的作用。本项目拟鉴定飞蝗卵子发生过程中起关键作用的microRNA，明确其靶基因及功能，揭示飞蝗卵子发生期microRNA与JH信号通路的相互关系，阐明microRNA调节飞蝗卵子发生的分子机理。

飞蝗是重要农业害虫，繁殖能力强。它的卵巢为无滋式，其卵子发生包括卵黄生成、卵巢发育和卵母细胞成熟主要由保幼激素（JH）调控，但不清楚其中的分子机制。miRNA被认为是昆虫发育、变态与生殖的一个重要调控因子，但对miRNA调控昆虫生殖的研究报道并不多，也缺少昆虫卵子发生过程中JH与miRNA之间调控关系的报道。本项目立项的主要研究内容是鉴定飞蝗卵子发生过程中起关键作用的miRNA，明确靶基因及功能，揭示飞蝗卵子发生期miRNA与JH信号通路的相互关系，解析miRNA调节飞蝗卵子发生的分子机制。按照研究内容和计划，我们首先获得了成虫羽化后JH缺失和JH诱导的脂肪体miRNA差异表达谱，鉴定了83个上调miRNA和60个下调miRNA。分析了miRNA在羽化后0-6天的表达模式和在基因组中的组织模式，鉴定了25个miRNA簇。筛选miR-2~13~71簇（包括miR-2、miR-13a、miR-13b和miR-71）、miR-276、miR-184、miR-278、let-7a等进行了进一步研究。我们发现，miR-2~13~71的表达水平在成虫羽化后逐渐下降，受JH下调。过表达miR-2~13~71导致卵黄原蛋白（Vg）水平显著下降，卵形成受到抑制。双荧光素酶检测和Ago1-RIP实验表明，Notch是miR-2~13~71的靶基因。JH一方面上调Notch的表达，同时也通过抑制miR-2~13~71表达而维持Notch的水平，从而促进卵黄生成和卵成熟。我们还发现，miR-278和let-7a通过调控Kr-h1发挥作用，过表达miR-278和let-7a显著降低Kr-h1的表达水平，进而抑制Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟。研究成果揭示了miRNA在昆虫生殖中的重要作用以及保幼激素和miRNA协同促进卵黄生成和卵形成的重要机制。受本项目资助，已发表研究论文3 篇，投稿论文2篇，正在撰写论文1篇。培养博士研究生3名，硕士研究生3名，博士后1名。项目负责人在项目执行期内入选国家百千万人才工程，被授予有突出贡献中青年专家，获国务院政府特殊津贴。