介导特定DNA转移多结构域嵌合蛋白的构建与鉴定

裸质粒DNA曾以其安全、便捷、廉价等优越性受到广泛关注，但质粒DNA转导效率低下、转染制剂毒性高、目的基因表达量不足等缺陷使其发展受限。GAL4是酵母转录激活因子，能特异识别并以二聚体形式结合UAS序列。GAL4的特异性DNA结合活性和核定位活性，可用于完成高效、低毒的DNA转导，具有在基因转导领域的研发潜质。Tat作为CPP，具有在胞外环境直接侵入胞内，甚至细胞核的功能，并已成功应用于将异源蛋白质、纳米微球、脂质体、噬菌体和病毒载体等外源物质导入细胞，显示了其在基因治疗非病毒载体领域的用途。本研究拟筛选利用GAL4的DNA识别/结合基元和Tat的核定位/入胞基元，构建一种具有特异性识别、结合质粒DNA，并将特定质粒DNA导入细胞/细胞核功能的重组蛋白/多肽。为基于质粒DNA的基因治疗非病毒载体提供一种高效、低毒的辅助转导系统，拓展裸质粒DNA的应用空间。

本研究利用GAL4 和HIV-1 Tat构建了一种新的基因工程嵌合蛋白TG和TNG。本研究通过荧光显微镜评估了TG或TNG介导的细胞转导功能，结果表明，HepG-2细胞与TG/pUAS-EGFP 和TNG/pUAS-EGFP 复合物共培养显示强绿色荧光，而HepG-2细胞与G/pUAS-EGFP和 NG/pUAS-EGFP复合物不显示荧光。这些结果表明含有Tat的融合蛋白TG或 TNG可介导高效的基因转移，并有效表达外源基因。 .通过MTT方法鉴定了TG 和TNG在HepG-2细胞内的抗肿瘤活性。结果显示TG/pUAS-Apoptin 和TNG/pUAS-Apoptin 不同程度地杀伤HepG-2细胞，而TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin之间的抗肿瘤效应没有明显差异。治疗剂量一定时，TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin的抗肿瘤效应具有一定的时间-效应关系。.通过AO/EB、DAPI、Caspases、△φ 和ROS方法检测，我们分析了TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin介导的抗肿瘤机制。结果显示TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin复合物可诱导HepG-2细胞凋亡。.通过小鼠模型可以观察到TG/pUAS-Apoptin 和TNG/pUAS-Apoptin的体内抗癌活性。结果显示TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin治疗组具有不同程度的抗肿瘤效应。而二者的抑制率没有明显差异。平均存活率结果显示TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin治疗组的存活率分别为66.7% 和83.3%，均明显高于盐水组、pUAS 和pUAS-Apoptin治疗组。另外，TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin 对IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度和NK、CTL的活性没有影响。.总之， GAL4/147 对UAS具有特异性识别活性，Tat具有穿膜活性，本研究基于二者构建的融合蛋白TG 和TNG能够转染含有UAS序列的质粒，通过质粒内的Apoptin能有效抑制人肝癌细胞HepG-2生长，限制肿瘤动物模型生长。本研究为扩大裸质粒DNA的应用提供了新的空间。