NP_785232蛋白N端特定结构域黏附肠道的分子机制研究

乳酸菌对肠道的黏附是其定植并发挥益生功能的先决条件之一，一些具黏附功能的乳酸菌分子已被发现，但是，现有研究中很少报道与这些黏附分子相互作用的肠道分子。本项目利用特异的亲和层析柱对与植物乳杆菌NP_785232蛋白N端特定结构域相互作用的肠道黏液蛋白分子进行配体垂钓，Western鉴定相互作用，之后再通过表面等离子共振（SPR）对相互作用进一步检测和鉴定，从而在分子水平上阐明NP_785232蛋白N端特定结构域黏附肠道的分子机制。项目的特色在于利用高特异性的配体垂钓使得从复杂肠道分子中获得专一性的互作分子成为可能，再通过SPR技术对相互作用进行超敏感检测。项目的完成将获得与植物乳杆菌NP_785232蛋白N端特定结构域相互作用的肠道黏液蛋白以及两者之间的相互作用常数，为弄清乳酸菌黏附的分子机制奠定基础，并可建立一套垂钓获得与乳酸菌表面蛋白互作的肠道分子的新技术体系。

乳酸杆菌是动物胃肠道内微生态系统的重要组成部分，其具有的肠道黏附和定植能力为其益生功能的发挥提供了先决条件。本课题以植物乳杆菌NP_785232蛋白N端特定结构域（His-N2重组蛋白）为研究对象，通过配体垂钓技术获得与其互作的肠道分子并对肠道分子进行了鉴定；同时通过竞争性黏附实验，证实了His-N2重组蛋白对多种病原菌的黏附抑制作用，为益生菌益生功能的发挥提供了直接实验证据。具体研究过程及结果简述如下：. 首先应用PCR技术克隆His-N2蛋白基因，然后将其连入表达载体pET30a中构建重组表达载体，转化大肠杆菌表达菌株Rosetta (DE3)，构建了His-N2蛋白的体外表达体系；. 大量表达纯化His-N2重组蛋白，通过将其交联到琼脂糖表面构建配体垂钓分子，之后利用亲和色谱技术从猪肠粘液中获得了与该重组蛋白互作的肠道分子，证实了通过配体垂钓获得与乳酸菌黏附蛋白互作的肠道分子的技术体系的可行性；. 在此基础上，对获得的肠道分子进行了质谱鉴定，鉴定结果表明：猪肠粘液中与His-N2重组蛋白互作的肠道分子可能为血红蛋白α-亚基1亚型、血红蛋白β亚基、组蛋白H2B型2-F类异构体2和正五聚体蛋白，正在进一步研究其与His-N2蛋白的相互作用；. 与此同时，通过固定猪肠粘液，在体外模拟肠道环境条件下，研究了不同pH值条件和His-N2重组蛋白浓度对大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和志贺氏菌的粘液黏附抑制作用，发现His-N2重组蛋白均能显著抑制各病原菌对猪肠粘液的黏附，进一步证实了His-N2重组蛋白对某些病原菌的竞争性黏附抑制作用，为益生菌黏附分子对宿主提供对抗病原菌黏附定植的作用提供了直接的实验证据。. 项目实施过程中已发表学术论文5篇（其中SCI收录3篇），授权专利1项，培养研究生1名，且该名研究生获得了校级国家奖学金。