借助炎症微环境中lncRNA的差异表达探讨祛瘀法防治股骨头坏死机制

Inflammatory microenvironment in osteonecrosis of femoral head （ONFH）inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells，which disturbs the balance of osteoblastic and osteoclastic genesis and lead to the collapse of femoral head. Runx2 is an important transcription factor in osteogenic differentiation, which can be inhibited by actived NF-κB signal pathway in Inflammatory microenvironment. Recent study showed that long non-coding RNA played an important role in osteogenic differentiation，and their expression was regulated by inflammatory cytokine. The methods of High-throughput lncRNA chip、Immune luciferase system 、small interaction RNA and Gene over-expression will be adopted to explore the differential expression of lncRNA in Inflammatory microenvironment，and to screen the objective lncRNA aimed at runx2 and/or NF-κB signal pathway, and to verify their function in osteogenic differentiation and relationship with the chinese traditional medicine of Removing blood stasis. The relationship between objective lncRNA and pathologic characters of osteonecrosis of femoral head will be explored in animal models and human tissue samples, which will reveal the mechanism of chinese traditional medicine of Removing blood stasis in the treatment of ONFH. Finally the significance of "removing blood stasis and promoting tissue regeneration" in the treatment of ONFH will be defined.

股骨头坏死后头内中存在炎症微环境，并可通过抑制骨髓间充质干细胞成骨分化破坏修复反应中成骨-破骨的平衡，最终导致股骨头塌陷。runx2是成骨分化过程中重要转录因子，在炎症微环境中受到激活的NF-κB信号通路的抑制。最新研究发现多种长链非编码RNA参与干细胞成骨分化，并且其表达受到炎症因子的调控。本研究拟采用高通量lncRNA芯片、免疫荧光素酶报告系统、基因沉默（siRNA）和基因超表达等技术，研究炎症微环境下骨髓间充质干细胞lncRNA的表达差异，筛选出以runx2及NF-κB信号通路为靶点的目标lncRNA，并探讨它们在成骨分化中的作用和祛瘀中药的关系。并借助股骨头坏死动物模型和病人临床样本，研究目标lncRNA与股骨头坏死病理特点之间的关系，以及目标lncRNA在祛瘀法治疗股骨头坏死中的作用，从lncRNA角度阐明"祛瘀生新"在股骨头坏死治疗中的意义。

本课题主要研究三个部分：第一部分以骨髓间充质干细胞为对象，原计划通过将BMSC暴露在TNF-a中，模拟股骨头坏死修复区局部微环境，通过高通量lncRNA芯片比较TNF-a刺激前后BMSC中lncRNA的表达差异，我们发现lncRNA-Miat、TINCR、Fendrr等具有显著差异；研究中我们发现TNF-α对runx2具有重要的调节作用，故我们进行了更深入的研究，从甲基化水平深入探讨了TNF-α在股骨头坏死中的分子作用机制，以期结合lncRNA测序结果从甲基化水平探讨股骨头坏死病理修复机制。第二步，通过差异倍数、邻近编码基因信息分析、基因位点比对、phylop物种进化保守性评分、表达验证等多步筛选策略初步筛选在炎症环境中与runx2基因表达相关的lncRNA（Miat）。采用沉默技术，从组蛋白修饰水平探讨了lncRNA-Miat对BMSC成骨分化的活血通络胶囊影响机制；研究过程中，我们分设计了lncRNA-Miat、TINCR、Fendrr的慢病毒，但只有lncRNA-Miat对成骨具有明显的促进作用，而TINCR对干细胞的归巢则有明显的促进作用，故我们后期通过荧光素酶报告系统研究其对Wnt2表达的影响。第二部分以动物为对象，经过文献查阅与前期的研究基础，我们将动物模型的对象从更改成新西兰兔，探讨了祛瘀法（通络生骨胶囊）促进新西兰兔激素性股骨头坏死修复的机制，验证了激素性股骨头坏死的修复与ABCB1、RUNX2、PPARγ基因等相关成骨基因的关系，从动物模型方面为后期寻找以ABCB1、RUNX2、PPARγ基因为靶点的目标lncRNA提供研究基础。 第三部分采用人骨质样本，通过病理组织切片，阐明runx2、TNF-α、lncRNA-Miat与骨坏死修复反应的关联。从而阐述了活血祛瘀法对lncRNA-Miat的影响及其在促进骨坏死修复中具体的作用机制。但是在研究过程中，虽然已经收集了大量的股骨头坏死标本用于本课题研究，并采取了各种方法优化股骨头坏死的收集方法，不过由于收集的股骨头坏死标本RNA 出现降解，达不到测序要求。故仍然无法以人股骨头坏死病灶为样本进行lncRNA测序，阐明lncRNA X、lncRNA Y 与股骨头坏死修复反应的关联。